高浓度二氧化碳预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨高浓度二氧化碳(CO2)预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 人脐静脉内皮细胞接种于细胞培养板,随机分为6组,每组16孔,对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(MR组)缺氧4 h、复氧24 h;缺氧预处理组(APC组)缺氧10 min、复氧10 min,重复2次后缺氧4 h、复氧24 h;HCA.组、HCA2组和HCA3组分别于50%N-20%02-30%CO2培养箱中行30%CO2预处理10、30、60 min后常规培养10、20、30 min,缺氧4 h、复氧24 h.于复氧24 h时采用MTY法测定人脐静脉内皮细胞活力,采用免疫细胞化学法测定细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达水平.结果 与C组比较,MR组、APC组、HCA1～3组人脐静脉内皮细胞活力降低,ICAM-1表达上调(P＜0.05);与A/R组比较,APC组和HCA2组人脐静脉内皮细胞活力升高,APC组及HCA1,2组ICAM-1表达下调(P＜0.05).结论 高浓度CO2预处理可减轻人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤.     

缺氧微环境对胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化的诱导作用

目的 探讨胰腺癌细胞在缺氧微环境中通过发生上皮向间叶转化(EMT)从而获得侵袭性表型的可能机制.方法 在缺氧微环境下培养胰腺癌细胞Pane-1、Transwell侵袭小室对比检测细胞在缺氧微环境下侵袭能力的变化情况.Western blot、免疫荧光检测缺氧对Panc-1细胞上皮细胞标记分子E-cadherin、间叶细胞标记分子vimentin表达的影响;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测缺氧对EMT诱导因子Snail表达的影响.将编码HIF-1α cDNA的真核表达载体pCD-NA 3.1-HIF-1α瞬时转染Panc-1细胞,Western blot检测HIF-1α对E-cadherin、vimentin表达的影响.结果 常氧组细胞每高倍镜视野穿透数为(84±3)个,缺氧组为(121±5)个,差异有统计学意义(P<0.01).Panc-1细胞在常氧、缺氧12 h、缺氧24 h、缺氧48 h条件下E-cadherin蛋白的相对值分别为(0.59±0.04、54.00±0.05、0.45±0.10、0.36±0.03);vimentin蛋白的相对值分别为:(0.36±0.05、0.41±0.04、0.48±0.06、0.58±0.05),缺氧同常氧组比较差异有统计学意义(P<0.05).缺氧微环境下Panc-1细胞Snail mRNA的表达量升高,在缺氧第3天后差异具有统计学意义(P<0.05).Panc-1细胞转染HIF-1α前后,E-cadherin蛋白的相对值分别为0.63±0.05、0.47±0.07;Vvi-mentin蛋白的相对值分别为0.47±0.07、0.32±0.04,转染前后差异有统计学意义(P<0.05).结论 缺氧微环境可能通过活化HIF-lα、Snail等转录因子,促进胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化,产生侵袭性表型.     

低氧三维培养微环境通过HIF-1α信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖机制的研究

目的探究低氧三维培养微环境对骨髓间充质干细胞增殖的影响及影响机制。方法 P5代小鼠骨髓间充质干细胞和聚-3羟基丁酸酯-co-4羟基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]分别在三维常氧(20%)和三维低氧(4%)条件下共同培养,24 h后CCK-8法测定两组细胞的增殖情况;12 h后实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)检测HIF-1α基因表达水平;24 h后Western blotting检测两组HIF-1α蛋白的表达情况。结果共同培养24 h后,CCK-8法检测显示低氧组OD值显著大于常氧组(0.455±0.027 vs. 0.352±0.090,n=12,P0.05);低氧培养12 h后,低氧组的HIF-1αmRNA表达水平显著高于常氧组(P0.05);低氧培养24 h后,同常氧组(0.47±0.05)比较,低氧组(0.63±0.06)HIF-1α蛋白相对表达水平显著增高(n=3,P0.05)。结论低氧三维微环境可促进骨髓间充质干细胞的增殖,这种效应可能与HIF-1α信号通路的激活有关。     

低氧对小鼠骨髓间质干细胞增殖及黏附的影响

目的 观察低氧环境对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖、黏附及分泌的影响.方法 采用细胞增殖实验、细胞黏附实验及Western blot分别观察小鼠MSCs在低氧(6%O2)和常氧(21%O2)的增殖、黏附,及纤连蛋白(FN)和玻璃粘连蛋白(VN)的表达.结果 低氧组10d内培养即可扩增到(1.20±0.19)×105细胞/孔,明显高于常氧组(0.65±0.08)×105细胞/孔(P<0.05);低氧组24 h细胞黏附率(88.64±1.4)%高于常氧组(60.83±1.6)%(P<0.05),同时FN和VN的蛋白表达显著增加.结论 低氧作为体外的一种可控制因素,调节MSCs的增殖及黏附功能,对于MSCs的组织工程的应用具有一定的意义.     

异氟烷对原代培养的缺氧/复氧损伤心肌细胞活力及线粒体通透性转换的影响

目的 在原代培养SD乳鼠心肌细胞上观察异氟烷(isoflurane,Iso)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤心肌细胞活力及线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)的影响. 方法 1 d～3 d龄SD乳鼠心肌细胞原代培养48 h后,建立H/R模型.将培养细胞按孔随机分为5组(n=6),在缺氧期予Iso和苍术苷(atractyloside,Atra)处理:①Normal组:在37℃的CO2培养箱中孵育细胞5 h(95%空气+5%CO2);②H/R组:缺氧(95% N2+5% CO2)3 h,复氧(95%空气+5% CO2)2 h;③Atra组:缺氧3 h,缺氧期给予20μ的Atra,复氧2h;④Iso0.4组:缺氧3 h,缺氧期给予0.4mmol/L Iso,复氧2h;⑤Atra+Iso0.4组:缺氧3 h,缺氧期给予0.4mmol/L Iso和20 μmol/L Atra,复氧2 h.复氧50min后,以Calcein-AM染色心肌细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的开放;复氧2 h后,MTT法测定心肌细胞活力.结果 复氧2 h后,Normal组、H/R组、Atra组、Iso0.4组、Atra+Iso0.4组吸光度分别为0.442±0.010、0.417±0.006、0.413±0.007、0.462±0.011、0.452±0.008,Normsl组、Iso0.4组、Atra+Iso0.4组明显高于H/R组、Atra组(P<0.01);H/R组吸光度与Atra组差异无统计学意义(P>0.05).复氧50 min后,Normal组、Iso0.4组、Atra+Iso0.4组Calcein保留在线粒体内,胞浆荧光强度较弱;H/R组、Atra组Calcein从线粒体释放到胞浆,胞浆荧光强度较强. 结论 ①缺氧期Iso处理可以明显抑制心肌细胞MPTP开放,减轻缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)引起的心肌细胞损伤,保存细胞活力;②缺氧期给予Atra不能逆转Iso的心肌保护作用.     

甘氨酸对缺氧大鼠心肌细胞的保护作用及机制

目的探讨甘氨酸对缺氧大鼠心肌细胞的保护作用及机制。方法分离培养SD乳鼠心肌细胞,用生化分析仪检测缺氧后6h及甘氨酸处理后心肌细胞培养液中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的释放量;用免疫组织化学方法观察常氧及缺氧心肌细胞甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)的表达;激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙及心肌细胞膜电位的变化。结果缺氧后6h心肌细胞培养液中CK、LDH值[(393.8±5.3)、(1564±41)U/L)]均升高,甘氨酸处理后CK、LDH值[(56.3±2.7)、(716±18)U/L]均明显下降(P<0.01).常氧及缺氧心肌细胞GlyRα1均呈阳性表达。常氧心肌细胞钙离子平均荧光强度为27±8,缺氧后6h增加为139±29(P<0.01);而甘氨酸处理后细胞钙离子平均荧光强度为51±11,与缺氧后6h比较明显减少(P<0.01),与常氧下比较却明显增加(P<0.01).常氧心肌细胞膜电位为177±20,缺氧后6h膜电位发生去极化(62±9,P<0·01);而加入甘氨酸后心肌细胞膜电位为123±16,较缺氧后6h时的去极化程度明显减轻(P<0·01).结论甘氨酸对缺氧心肌细胞有保护作用,其可能的机制是甘氨酸与其受体结合后,减轻了心肌细胞膜去极化,从而减少了细胞膜电压依赖性钙通道开放,使钙离子内流减少。     

PCNA在大鼠肾上腺细胞培养中的表达及其意义

目的:探讨增殖细胞核抗原(PCNA)在大鼠肾上腺细胞培养过程中的表达及其意义。方法:应用SP免疫组化法,检测PCNA在大鼠肾上腺细胞培养不同时期表达的强度变化,同时测定肾上腺细胞分泌皮质酮功能的动态变化。结果:在肾上腺细胞体外培养过程中,第3、5、7天,PCNA蛋白表达逐渐增强,分别为(18±3)%、(38±5)%、(70±6)%,第9、11天与第7天相比,PCNA蛋白表达减弱(P<0.05),皮质酮浓度测定显示在第7天皮质酮浓度达到最高峰(101.2±15.8nmol/L),随后逐渐下降,与PCNA蛋白表达强度的变化趋势一致。结论:肾上腺细胞体外培养在第7天肾上腺细胞增殖最旺盛,而且肾上腺分泌皮质酮达到最高峰。     

缺氧诱导因子1α对缺氧条件下大鼠心肌细胞糖酵解的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对缺氧状态下大鼠心肌细胞糖酵解的影响。方法常规分离、培养大鼠心肌细胞,分为单纯缺氧组:使用无糖培养基在低氧混合气体(体积分数94%N2、5%CO2、1%O2)中培养;HIF-1α抑制组:先利用RNA干扰技术构建HIF-1α蛋白低表达的细胞模型,再作上述缺氧培养。两组细胞均设缺氧前(常规培养)及缺氧1、3、6、12、24h6个时相点,采用生物化学方法检测细胞中糖酵解关键酶己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性以及培养上清液中乳酸(LA)的含量。结果(1)HK、PFK活性:与缺氧前比较,两组心肌细胞两酶活性均呈先升高后下降的变化趋势。单纯缺氧组两酶活性峰值分别为(159±13)、(298±44)U/g.HIF-1α抑制组两酶活性在缺氧1、3、6h时均明显低于单纯缺氧组(P<0.05或0.01),其峰值分别为(133±55)、(188±55)U/g.(2)LDH活性、LA含量:与缺氧前(92±12)U/g比较,单纯缺氧组细胞LDH活性缺氧后显著升高,6h时达高峰(2568±125)U/g(P<0.01),随后逐渐下降;各时相点培养上清液中LA含量也成倍增加。HIF-1α抑制组细胞的LDH活性于缺氧3h时达峰值(2125±126)U/g,明显高于缺氧前(P<0.01);培养上清液中LA含量亦较缺氧前增高(P<0.01),但增幅较小。结论缺氧条件下大鼠心肌细胞中HIF-1α高表达是细胞糖酵解持续增强的直接原因,此为心肌细胞应对缺氧环境的重要内源性保护机制。     

不同程度低氧培养对多孔钽-人成骨细胞复合物细胞形态及COL-Ⅰ、OC蛋白表达的影响

[目的]探讨低氧培养条件对多孔钽-成骨细胞形态学、增殖能力以及COL-Ⅰ、OC蛋白表达的影响。[方法]选用MG63成骨细胞原代培养及传代。将第3代细胞以1×10~6/L~(-1)细胞浓度接种于多孔钽材料进行复合培养。采用三气培养箱,以20%氧体积分数作为常氧环境,氧体积分数2%作为缺氧环境,同时设1%及3%氧体积分数作为缺氧反应对比条件。实验分组:将多孔钽-成骨细胞复合物分为4组:常氧钽组(对照组),3%缺氧钽组、2%缺氧钽组及1%缺氧钽组(实验组)。CCK-8法检测多孔钽-成骨细胞复合培养第1、3、5、7、9、11 d各组成骨细胞生长和增殖状态;扫描电镜观察缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物形态特征影响;透射电镜观察缺氧条件下成骨细胞超微结构改变;免疫细胞化学法检测缺氧各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC蛋白的表达。[结果]CCK-8法检测显示缺氧条件下各实验组与对照组比较,细胞随培养时间的延长,成骨细胞生长及增殖速度明显放慢,除第1 d外,其余各时间点OD值差异均有统计学意义(P<0.05);各实验组组间比较除第3 d外,其余时间点各组间比较差异均存在统计学意义(P<0.05),扫描电镜显示在缺氧条件下多孔钽-成骨细胞对缺氧反应表现为体积变小,伪足少而细,只分泌极少量的细胞外基质覆盖于多孔钽表面。透射电镜显示:在缺氧条件下钽-成骨细胞复合培养与常氧培养的成骨细胞相比,线粒体、内质网扩张,空泡样变性,线粒体嵴断裂或消失。免疫细胞化学检测结果得出:缺氧条件下各实验组成骨细胞COL-Ⅰ、OC蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05)。[结论]多孔钽-成骨细胞复合物在缺氧条件下成骨细胞增殖能力降低,细胞形态及超微结构改变,功能降低以及成骨蛋白COL-Ⅰ、OC表达降低。提示:监测骨缺损局部氧分压将有助于三维结构骨移植材料内部成骨细胞生长及骨形成量。     

利多卡因对N-甲基-D-天冬氨酸抑制大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖的影响

目的 观察利多卡因对 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)抑制大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)增殖的影响。方法 将体外培养的 PC12细胞分为6组，分别采用正常不含药液的培养基(C组)；含400μmol·L(-1)NMDA 的培养基(N组)；NMDA 分别混合10μmol·L~(-1)(L_1组)、10~2μmol·L~(-1)(L_2组)、10~3μmol·L~(-1)(L_3组)以及10~4μmol·L~(-1)(L_4组)利多卡因的培养基培养5d，应用流式细胞仪测定细胞 DNA 相对含量，解析细胞周期，计算 S 期细胞荧光强度占受测细胞总荧光强度的百分数为 S期分数(SPF)和 S 期与 G_2期细胞荧光强度之和与 M 期细胞荧光强度的比值[(S G_2)/M]。结果 与C 组比较，N、L_1组 SPF 和(S G_2)/M 均降低(P<0.05)，L_4组 SPF 降低(P<0.05)，而 L_2及 L_3组 SPF和(S G_2)/M 差异无统计学意义(P>0.05)。与 N 组比较，L_2、L_3及 L_4组 SPF 和(S G_2)/M 升高(P<0.05)，L_1组 SPF 升高(P<0.05)，而(S G_2)/M 差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NMDA 可以通过抑制 PC12细胞 DNA 合成而影响细胞的增殖活性，利多卡因能拮抗 NMDA 对 PC12细胞增殖的抑制作用。     

c-Jun氨基末端激酶信号通路对缺氧上调血管内皮细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响

目的 了解缺氧对钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）表达的影响及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在其中的作用。方法 将人血管内皮细胞株EA．hy926进行缺氧处理3h后继续常规培养0、12、24、48、72h，同时设常氧培养对照。采用蛋白质印迹法检测CASK的表达。构建CASK启动子区荧光素酶报告基因质粒。用其转染细胞后，于常氧及缺氧培养1、3、6、12h裂解细胞提取总蛋白，检测报告基因萤火虫荧光素酶及内参照海肾素荧光素酶活性，并用蛋白质印迹法检测JNK磷酸化情况。在培养的细胞中分别加入不同剂量（0、10、100nmo/L，1、10μmol／L）的JNK抑制剂SP600125预处理1h后再缺氧培养3h，观察其对CASK表达的影响。结果缺氧处理后常规培养0～72h，细胞CASK持续保持高表达，并明显高于常氧组。随着缺氧时间延长荧光素酶相对活性普遍增加，均高于常氧组（0．010±0．003，P〈0．01），且缺氧12h达峰值（0．192±0．023）。JNK的磷酸化随缺氧时间延长逐渐增强。加入SP600125后，CASK的表达显著降低，并呈剂量一效应依赖性，其浓度为10μmol／L时，抑制效率达高峰。结论 缺氧上调血管内皮细胞CASK的表达部分依赖于JNK信号通路活化。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响

目的 了解胰岛素样生长因子I(IGF-I)对缺血缺氧致心肌细胞凋亡的影响,探讨其调控机制.方法 分离培养SD乳鼠的心肌细胞.于制备缺血缺氧心肌细胞模型(缺血缺氧组)前1 h,用IGF-I(200μg/L)进行干预(干预组),以缺血缺氧组致伤前测定结果为正常对照(对照组).观察不同时相点心肌细胞凋亡的吸光度(A)值、线粒体膜电位变化及磷酸化Akt蛋白表达变化.结果 对照组心肌细胞凋亡A值为0.18±0.03;缺血缺氧后1、3、6、12 h分别为0.33±0.05、0.61 ±0.06、1.17±0.08、2.25±0.11,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);干预组上述时相点的A值分别为0.26±0.04、0.49±0.05、0.84±0.06、1.63±0.09,与缺血缺氧组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).缺血缺氧6、12 h,心肌细胞线粒体膜电位荧光强度较对照组40.2±10.1下降,分别为18.7±5.1、6.3±1.9(P＜0.01),干预组较缺血缺氧组相对增高,分别为28.8±6.2、12.5±3.1(P＜0.05).与对照组比较,其余各组缺血缺氧后6 h磷酸化Akt蛋白表达量增加.结论 IGF-I对缺血缺氧心肌细胞具有抗凋亡作用,其机制可能与IGF-I激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt、增加磷酸化Akt表达、减少细胞色素c的释放有关.     

热休克蛋白90对大鼠缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶表达的影响

目的探讨内源性热休克蛋白90（HSP90）在缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）相关信号通路中的作用。方法建立新生Wistar大鼠心肌细胞缺氧模型，将细胞分为正常组、缺氧组、加入HSP90特异性阻断剂格尔德霉素后再缺氧组（格尔德霉素＋缺氧组）。于缺氧后1、3、6、12、24、48h用噻唑蓝法检测心肌细胞的活力；缺氧24h，原位缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡指数（AI）；缺氧1、3、6、12、24h，蛋白质印迹法检测大鼠心肌细胞中内源性HSP90及AKT表达水平。结果（1）缺氧24、48h，缺氧组、格尔德霉素＋缺氧组细胞活力均较正常组明显下降（P〈0．05）；格尔德霉素＋缺氧组细胞活力缺氧12h即开始明显下降，缺氧48h时明显低于缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧24h，缺氧组细胞AI为（10．7±1．2）％，明显高于正常组[（1．9±0．3）％．P〈0．05]；格尔德霉素＋缺氧组细胞AI为（26、3±5．3）％，明显高于缺氧组（P〈0．01）。（3）缺氧12h，缺氧组心肌细胞内源性HSP90及AKT表达水平高于正常组与格尔德霉素＋缺氧组；缺氧24h，缺氧组有所下降．格尔德霉素＋缺氧组则下降更明显。结论内源性HSP90对维持心肌细胞的活力有重要作用．缺氧心肌细胞AKT表达水平可受内源性HSP90表达水平的影响。     

微管干预剂对缺氧心肌细胞糖酵解途径关键酶的影响

目的 了解微管干预剂对缺氧心肌细胞糖酵解途径关键酶的影响. 方法体外培养心肌细胞,分为单纯缺氧组、缺氧+微管解聚剂(秋水仙碱)组、缺氧+低浓度微管稳定剂组、缺氧+中浓度微管稳定剂组、缺氧+高浓度微管稳定剂组,后3组加入的微管稳定剂为紫杉醇,浓度分别为5、10、15 μmol/L.采用激光共聚焦显微镜观察微管形态学变化,检测细胞活力及己糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶的活性. 结果缺氧+微管解聚剂组和缺氧+高浓度微管稳定剂组心肌细胞微管结构破坏显著,细胞活力亦明显下降[缺氧1.0 h,2组细胞活力分别为(89.99±3.47)%、(84.56±6.61)%,明显低于单纯缺氧组(97.44±1.76)%(P<0.01)],前3种酶的活性亦明显降低;缺氧+低浓度微管稳定剂组前3种酶的活性与单纯缺氧组基本近似;缺氧+中浓度微管稳定剂组微管结构损伤显著轻于其他组,前3种酶的活性于缺氧6.0 h内高于单纯缺氧组.缺氧后各组乳酸脱氢酶活性升高. 结论适当浓度的微管稳定剂能明显减轻微管结构损伤,促使缺氧早期心肌细胞糖酵解酶活性增强.     

胰高血糖素样肽-2对烧伤大鼠肠粘膜细胞增殖的影响

目的　探讨胰高血糖素样肽 2 (GLP 2 )对烧伤大鼠肠粘膜细胞增殖及肠粘膜结构的影响。　方法　 5 5只Wistar大鼠随机分为烧伤组、GLP 2组 (烧伤后经GLP 2处理 ,2 0 0 μg/kg ,2次 /d腹腔注射 )与正常对照组。前两组动物于 30 %TBSAⅢ度烧伤后 6、12h及 1、3、5d分别处死 ,另处死正常对照组大鼠。检测各组增殖细胞核抗原 (PCNA)、细胞周期蛋白CyclinD的表达情况以及血浆二胺氧化酶 (DAO)的活性 ,并行肠粘膜组织学观察。　结果　与正常对照组比较 ,烧伤组伤后 6、12hPCNA表达稍有增强 ,伤后 1d减弱 ,3d时最低 ,5d时仍低于正常 ;GLP 2组PCNA表达的变化在伤后早期与烧伤组基本一致 ,但伤后 3、5d时强于烧伤组。烧伤组大鼠肠粘膜CyclinD蛋白在伤后 6、12h略有升高 ,但 1d时迅速下降至伤前的 4 0 % ,而GLP 2组CyclinD蛋白表达在伤后 1、3、5d高于烧伤组。大鼠烧伤后血浆DAO活性明显升高 ,经GLP 2治疗 5d后该指标明显降低 (P <0 .0 1)。组织学观察见GLP 2组肠绒毛排列较为规则 ,长短较一致 ,未见明显的上皮脱落。　结论　大鼠烧伤后腹腔给予外源性GLP 2能减轻肠粘膜损伤 ,其机制可能与GLP 2使PCNA、ClyclinD表达增加、促进受损肠粘膜细胞增殖有关。     

微管干预剂对大鼠缺氧心肌细胞能量生成的影响

目的 了解缺氧条件下微管干预剂对大鼠心肌细胞能量生成的影响。方法 常规分离、培养大鼠心肌细胞，分为单纯缺氧组、缺氧＋秋水仙碱（微管解聚剂）组及缺氧＋5、10、15 mmol／L紫杉醇（微管稳定剂）组。每组细胞加入刺激剂后，缺氧培养0．5、1．0、3．0、6．0、12．0、24．0h。采用锥虫蓝染色检测细胞死亡率，常规比色法检测细胞肌酸激酶（CK）活性，高效液相色谱法检测细胞腺苷三磷酸（ATP）及腺苷二磷酸（ADP）含量。结果 （1）缺氧＋秋水仙碱组及缺氧＋15mmol／L紫杉醇组细胞培养1．0～24．0h死亡率均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmoL／L紫杉醇组6．0～24．0h时均低于单纯缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧＋秋水仙碱组培养1．0～12．0h时CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）。0．5～12．0h时，缺氧＋15mmoL／L紫杉醇组CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组（P〈0．05或P〈0．01）。（3）缺氧＋5mmol／L紫杉醇组培养0．5～6．0h ATP含量[（49．9±2．8）、（40．7±2．0）、（25．8±1．9）、（19．1±1．2）μg／10^6个细胞]高于单纯缺氧组[（42．9±5．8）、（29．5±1．8）、（18．2±0．9）、（14．1±0．7）μg／10^6个细胞，P〈0．05或P〈0．01]。0．5～12．0 h时，缺氧＋秋水仙碱组低于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋15mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组及缺氧＋10mmol／L紫杉醇组（P〈0．01）。各组ADP含量变化趋势与ATP相反。结论 微管解聚剂和高浓度微管稳定剂可使缺氧心肌细胞ATP含量锐减。适宜浓度的微管稳定剂在缺氧早期可促进心肌细胞能量生成，对心肌具有保护作用。     

Anti-angiogenic effect of silymarin on colon cancer LoVo cell line

OBJECTIVE: This study was designed to evaluate the anti-angiogenic effect of silymarin (SM) and its major pure component silibinin (SB), and also thalidomide (TH). MATERIALS AND METHODS: A modified in vitro system using a coculture of endothelial (EA.hy 926) and colon cancer (LoVo) cell lines was adopted in this study. RESULTS: In cytotoxicity assay, SM/SB/TH concentrations causing 20% (IC(20)) inhibition of cellular growth were 41.8 microg/ml/0.22 mM/0.088 mM for EA.hy 926 cells, and 16.1 microg/ml/0.12 mM/0.099 mM for LoVo cells, respectively. All 3 drugs showed concentration dependent inhibition of migration and differentiation assay. The IC(50) inhibiting chemotaxis migration of EA.hy 926 towards LoVo by SM/SB/TH was 1.15 microg/ml/0.66 microM/1.98 microM, respectively. In differentiation assay, SM/SB/TH inhibited in vitro capillary tube formation by 50% at 1.25 microg/ml/2.6 micro/6.3 microM, respectively. In an analysis of vascular endothelial growth factor secreted by LoVo cells, SM/SB/TH decreased 50% secretion at 6.52 microg/ml/6.6 microM/131.7 microM, respectively. CONCLUSION: SM/SB has a strong anti-angiogenesis effect on the colon cancer cell line, and this might provide an alternative treatment option for anti-cancer treatment.     

Fluvastatin induces apoptosis of vascular endothelial cells: blockade by glucocorticoids

Statins block de novo synthesis of cholesterol by inhibiting the enzyme, HMG CoA reductase. The product of this reaction, mevalonic acid, is also a precursor of isoprenoids, molecules required for the activation of signaling G-proteins, such as Ras. Signal transduction pathways involving Ras are important for cell survival and this may be why statins induce apoptotic death of several cell types. Given that statins are used to treat vascular disease, surprisingly no studies have been conducted on vascular endothelial cells. Here we show that fluvastatin (FS), at concentrations from 1-2 microM, blocks growth and induces apoptosis of the endothelial cell line, EA.hy 926. Considerable redundancy is known to exist in cell signaling and in vivo toxicity of FS might be prevented by other signaling pathways, like those activated by adrenal or sex steroids. RT-PCR analysis revealed the expression of the androgen and glucocorticoid receptor in EA.hy 926 cells. Although the androgen, dihydrotestesterone (DHT) had no effect, the glucocorticoid, dexamethasone (Dex), blocked FS-induced apoptosis. Cell cycle analysis revealed that 24 h exposure to FS prevented cells from leaving G(1) and 24-48 h later a marked sub-G(1) peak was observed. Dex was able to reduce the sub-G(1) peak, but it failed to block accumulation of cells in G(1), indicating that it's effect was specific for blockade of apoptosis, and not specific to an effect on FS alone. This study strongly suggests that glucocorticoids have a role to play in preventing vascular injury and they may provide the reason why statins are not inherently toxic to vascular endothelial cells, in vivo.