Ghrelin在糖尿病血管钙化中的作用

目的观察生长激素促分泌素(Ghrelin)在糖尿病血管钙化中的作用。方法选取江苏大学附属医院30例糖尿病足截肢患者。根据超声对下肢动脉狭窄程度的检测将患者分为轻度狭窄组(狭窄50%)(n=10)、中度狭窄组(50%≤狭窄70%)(n=10)及重度狭窄/闭塞组(70%≤狭窄≤100%)(n=10)。通过患者血清学、临床相关指标的检测以及截肢胫动脉组织连续石蜡切片HE染色、Von kossa钙染色、血管钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性检测及Western blot检测观察钙化。结果糖尿病截肢患者胫动脉超声、HE染色及Von Kossa染色一致显示:三组患者胫动脉中膜均有弥散的黑色钙盐;但相对于轻度狭窄和中度狭窄组,重度狭窄/闭塞组胫动脉粥样硬化斑块内可见大量点灶状的黑色钙盐沉积(超声为强回声的硬斑块)。定量检测显示重度狭窄组/闭塞胫动脉ALP活性及钙含量增加显著,分别是轻度狭窄组的2.44倍和2.39倍,但中度狭窄组与轻度狭窄组相比,无统计学差异。Western blot检测显示随着血管狭窄程度加重,病变组织Ghrelin、骨保护素(OPG)表达下调,细胞核因子受体活化因子配体(RANKL)表达上调。Pearson相关性分析显示糖尿病截肢患者血清Ghrelin可能与胫动脉钙含量呈负相关(r=-0.64,P0.001)、与OPG呈正相关(r=0.85,P0.001),与sRANKL呈负相关(r=-0.85,P0.001)。结论随着糖尿病患者血管钙化程度的加重,Ghrelin与OPG表达下调,而RANKL的表达上调,提示血清Ghrelin、OPG/RANKL水平对糖尿病患者不同级别血管钙化可能有一定预警价值。     

他汀的抑动脉钙化作用及对骨保护素/NF-κB配体受体的影响

目的:探讨他汀类药物对动脉中膜钙化的抑制作用及其对骨保护素(OPG)/NF-κB配体的受体(RANKL)的影响。方法:构建大鼠的主动脉中膜平滑肌细胞(SMC)的钙化模型,随机分为钙化组、他汀组和对照组。钙化组使用β-磷酸甘油、维生素C对SMC来进行钙化诱导;他汀组在上述基础上加入阿托伐他汀。用Von Kossa染色,钙离子含量测定,碱性磷酸酶(ALP)活性检测,骨钙素的Western Blot检测来判定细胞钙化的程度,用实时定量PCR检测细胞钙化过程中伴随的OPG和RANKL的表达情况。结果:加入他汀类药物后使得细胞钙化的程度得到减轻,同时细胞表达的OPG/RANKL比值也得到明显上升(均P0.05)。结论:他汀类药物具有抑制动脉钙化的作用,其机制可能与提高OPG/RANKL的比值有关。     

大鼠主动脉钙化过程中骨保护素/NF-κB配体的受体变化及意义

目的:研究大鼠主动脉钙化过程中骨保护素(OPG)/NF-κB配体的受体(RANKL)变化及意义。方法:60只SD大鼠随机分为钙化组、他汀组和对照组,每组再分早、晚期两个亚组。钙化组给予华法林灌胃,他汀组给予华法林和阿托伐他汀灌胃。早期亚组在第17天、晚期亚组在第34天取大鼠主动脉,用Von Kossa染色,以碱性磷酸酶(ALP)活性检测与骨钙素Western Blot检测来判定钙化情况,用实时定量PCR检测OPG和RANKL的表达情况。结果:对照组无论早晚期都有大量的OPG表达,但没有RANKL表达。钙化组和他汀组早期OPG表达上升,晚期下降,而RANKL表达在钙化过程中一直呈升高趋势;对照组、他汀组、钙化组随着钙化程度的加重,OPG/RANKL比值呈逐步下降趋势(均P<0.05);同一组中,晚期亚组随着钙化的加重,OPG/RANKL比值也较早期明显下降(均P<0.05)。结论:OPG/RANKL的比值与主动脉钙化程度呈负相关,且阿托伐他汀具有抑制钙化的作用。     

维生素K_2对大鼠血管平滑肌细胞钙化及Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨维生素K_2对血管平滑肌细胞(VSMC)钙化及Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响。方法体外培养A7r5VSMC分为正常组(基础培养液),钙化组(加入10mmol/Lβ磷酸甘油),干预组(钙化基础上加入维生素K_210-6 mmol/L),各组均干预14d。Von Kossa染色观察VSMC钙化发生情况;检测细胞钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性;实时定量PCR及Western blot检测TLR2和TLR4mRNA和蛋白表达水平。结果钙化组细胞钙含量及ALP活性较正常组分别增加11.5倍和9.3倍(P<0.01);干预组细胞钙含量及ALP活性较钙化组分别减少1.5倍和2.3倍(P<0.01)。与正常组比较,钙化组细胞TLR2、TLR4蛋白及mRNA表达升高;与钙化组比较,干预组细胞TLR2、TLR4蛋白及mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论维生素K_2抑制细胞钙化的作用可能与TLR2和TLR4表达的下调有关。     

瑞舒伐他汀对动脉中膜钙化的作用及其对OPG/RANKL系统的影响

目的:探讨瑞舒伐他汀对动脉中膜钙化的抑制作用及其机制。方法:首先构建动物钙化模型,分为正常对照组、钙化组、小剂量瑞舒伐他汀组、中剂量瑞舒伐他汀组和大剂量瑞舒伐他汀组。钙化组使用华法林对大鼠灌胃诱导钙化,3个瑞舒伐他汀组在使用华法林灌胃的同时分别再加入5、10和15mg·kg-1·d-1的瑞舒伐他汀;动脉钙化的程度使用Von Kossa染色、钙离子含量、碱性磷酸酶(ALP)活性与骨钙素的WesternBlot检测结果来判断,此过程中骨保护素(OPG)与NF-κB配体的受体(RANKL)的表达用实时定量PCR来检测。结果:加入瑞舒伐他汀后,细胞钙化的程度有所减轻,且随着瑞舒伐他汀浓度的增加,钙化被抑制的程度也越明显,同时细胞中OPG/RANKL的比值上升也越明显。结论:瑞舒伐他汀具有抑制动脉钙化的作用,其机制可能与其提高OPG/RANKL的比值有关。     

外源性硫化氢对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响及其可能机制

目的探寻外源性硫化氢对人脐静脉平滑肌细胞(HUSMC)钙化的影响及机制。方法在成功复制HUSMC钙化模型基础上,给予硫氢化钠(Na HS)进行培养,实验分为6组(n=6):对照组、钙化组、单纯Na HS组(8.0×10-6mol/L Na HS)、钙化+Na HS高剂量组(4.0×10-5mol/L Na HS)、钙化+Na HS中剂量组(8.0×10-6mol/L Na HS)、钙化+Na HS低剂量组(1.6×10-6mol/L Na HS)。对各组HUSMC进行Von Kossa染色、显微图像分析,并检测各组碱性磷酸酶活性、钙离子含量,荧光定量PCR法检测细胞中骨桥蛋白mRNA的表达,放射免疫法检测培养液中骨桥蛋白含量。结果硫化氢可明显减少HUSMC钙结节的聚集生长,Von Kossa染色显示细胞聚集处棕褐色钙结节较钙化组明显减轻,差异有统计学意义(P0.05);钙化+Na HS高剂量组、钙化+Na HS中剂量组、钙化+Na HS低剂量组钙化细胞百分比、细胞钙含量和碱性磷酸酶活性较钙化组明显降低,差异有统计学意义(P0.05),培养液中骨桥蛋白含量及其细胞内骨桥蛋白mRNA表达均较钙化组减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论硫化氢可以减轻HUSMC钙化的程度,其机制可能是通过下调细胞内骨桥蛋白mRNA的表达,进而导致骨桥蛋白生成减少而实现的。     

1,25-(OH)_2D_3通过Ca~(2+)/CaM信号调控内皮细胞自噬抑制动脉粥样硬化钙化

目的探讨1,25二羟基维生素D_3(1,25-(OH)_2D_3)是否通过信号调控人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬抑制细胞钙化及小鼠动脉粥样硬化斑块内钙化。方法 (1)将体外培养的HUVEC高脂刺激自噬后予1,25-(OH)_2D_3干预后,通过荧光显微镜、透射电镜、蛋白免疫印记(Western blot)检测细胞自噬水平;利用慢病毒过表达或者沉默钙调蛋白(CaM),运用Western blot、茜素红染色法、钙检测试剂盒检测细胞钙化指标骨形态发生蛋白2(BMP-2)、碱性磷酸酶(ALP)。(2)取6～8周龄Apo E-/-雄性小鼠高脂饲养形成动脉粥样硬化模型,1,25-(OH)_2D_3灌胃后尾静脉注射CaM过表达或者沉默慢病毒,Western blot检测组织自噬及钙化水平指标;扫描电镜观察主动脉斑块自噬小体及钙沉积; HE及Von Kossa染色法分别检测小鼠主动脉粥样硬化及钙化程度。结果体外实验显示,1,25-(OH)_2D_3处理后细胞自噬增强,Ca~(2+_与CaM上调;与对照组相比,CaM过表达组自噬增强,细胞钙化减轻,ApoE-/-小鼠斑块内钙化明显被抑制; CaM沉默组细胞自噬流不通畅,细胞钙沉积增加; Apo E-/-小鼠斑块内钙化明显增加(P0.01)。结论 1,25-(OH)_2D_3通过Ca2+/CaM信号调控HUVEC自噬抑制细胞钙化及小鼠动脉粥样硬化斑块钙化。     

维生素K2对ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化内膜钙化和Toll样受体2及4表达的影响

目的探讨维生素K2对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化内膜钙化和Toll样受体2(TLR2)及TLR4表达的影响。方法 18只6周龄雄性Apo E-/-小鼠,随机分为模型组、维生素K2干预组及对照组,每组6只。模型组及维生素K2干预组小鼠予高脂饮食,对照组小鼠予普通饮食喂养。维生素K2干预组在高脂饮食基础上同时予维生素K2灌胃,每天1次,共12周。小鼠19周龄时处死,测定血清脂质水平;HE染色观察主动脉组织形态学变化,Von Kossa染色观察主动脉钙化;测定血管钙含量和碱性磷酸酶活性判断血管钙化程度;免疫组织化学法、实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测主动脉TLR2、TLR4蛋白和mRNA的表达。结果模型组小鼠主动脉HE染色可见内膜显著增厚,有典型的动脉粥样硬化斑块形成,Von Kossa染色斑块纤维帽下可见灶状黑色钙化团块,维生素K2干预组小鼠主动脉可见粥样硬化斑块,但Von Kossa染色斑块内未见明显黑色钙盐沉积;定量分析显示,维生素K2干预组小鼠主动脉血管壁钙含量和碱性磷酸酶活性均明显低于模型组(P0.01);免疫组织化学染色显示TLR2、TLR4主要表达于粥样硬化斑块内,qRT-PCR证实模型组小鼠主动脉TLR2、TLR4表达均显著高于对照组(P0.05),维生素K2干预组小鼠主动脉TLR2、TLR4 mRNA及蛋白水平较模型组明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。小鼠主动脉钙含量与TLR2 mRNA表达呈正相关(r=0.77,P0.001),与TLR4 mRNA表达亦呈正相关(r=0.79,P0.001)。结论维生素K2可降低高脂饮食Apo E-/-小鼠主动脉中钙含量和碱性磷酸酶活性,减少主动脉血管壁TLR2、TLR4的表达,维生素K2抑制内膜钙化的作用可能与下调TLR2、TLR4的表达有关。     

前列腺素E2调节大鼠成骨细胞RANKL/OPG mRNA表达的信号通路研究

目的 探讨前列腺素E2(PGE2)对大鼠成骨细胞RANKL和OPG mRNA表达的调节及其信号转导机制.方法 培养大鼠UMR106成骨细胞,采用不同浓度的PGE2、不同信号通路的激动剂和阻断剂干预细胞不同时间后收集细胞提取总RNA,实时荧光定量PCR检测RANKL和OPG mRNA的表达水平.结果PGE2、Forskolin和db-cAMP均可促进RANKL mRNA表达,抑制OPG mRNA的表达.PMA促进RANKL和OPG mRNA表达而A23187则下调RANKL和OPG表达.KT-5720下调PGE2诱导的RANKL mRNA表达约53%(P<0.001),而chelerythrine、维拉帕米、W7、KN-62和PD98059则对PGE2>诱导的RANKL mRNA表达无明显影响(P>0.05).KT-5720(P=0.01)、维拉帕米(P=0.029)和W7(P<0.001)均能部分阻断PGE2对OPG mRNA表达的下调作用,KN-62、PD98059和chelerythrine则不影响PGE2对OPG表达的调节(P>0.05).结论 PGE2诱导的RANKL表达是由PKA信号通路介导的,而PKA和钙/钙调蛋白信号通路则介导了PGE2对OPG表达的抑制作用.     

主动脉瓣体外钙化模型的建立

目的:探讨一种体外分离、扩增瓣膜间质细胞并诱导钙化的方法,建立体外瓣膜细胞钙化模型。方法:采用胶原酶消化法从新鲜猪主动脉瓣膜上分离并体外扩增瓣膜间质细胞,免疫荧光染色行细胞鉴定。4～8代间质细胞以含β-甘油磷酸的钙化培养基钙化诱导培养2周。钙化结节计数,茜素红S染色观察并检测钙沉积。实时定量逆转录聚合酶链反应(Real Time rt-PCR)检测α-平滑肌波动蛋白(α-SMA)及钙化相关因子骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子a1(Cbfa1)表达。结果:胶原酶消化法可从猪主动脉瓣膜上成功分离并体外扩增瓣膜间质细胞,α-SMA和波形蛋白(Vimentin)免疫荧光染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。钙化培养基体外钙化诱导培养1～2周可成功诱导钙化,间质细胞自发形成钙化结节,茜素红S染色阳性,钙沉积明显增加(P0.05)。实时定量逆转录PCR提示钙化间质细胞α-SMA表达上调,并相对高表达钙化相关因子(P0.05)。结论:胶原酶法联合钙化培养基可成功体外构建主动脉瓣膜细胞钙化模型。