通过维持微环境IL－2水平抑制肿瘤形成

为研究肿瘤微环境中ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制效应，用转基因方法，将携带ｍＩＬ－２ｃＤＮＡ基因的牛乳头瘤病毒载体（ＢＣＭＧ）转染小鼠Ｂ１６瘤细胞，获稳定持久分泌ｍＩＬ－２的Ｂ１６细胞株（ｍＩＬ－２＋Ｂ１６）。动物实验结果显示：ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞的致瘤性明显下降，但体外生长率与其亲代Ｂ１６细胞相比较无区别。用ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞诱导的小鼠腹腔渗出细胞（ＰＥＣ）对ＹＡＣ－１靶细胞和Ｂ１６靶细胞的体外杀伤能力比对照组ＰＥＣ（Ｂ１６诱导的ＰＥＣ）高一倍以上（Ｐ＜０．０１）。表明提高微环境中的ＩＬ－２水平能提高抗肿瘤免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的形成。     

mIL—2分泌型小鼠黑色素瘤细胞诱导的细胞免疫应答

用ｍＩＬ－２分泌型小鼠黑色素瘤细胞（ｍＩＬ－２＾＋Ｂ１６）植入同种小鼠（Ｃ５７ＢＬ／６）腹腔内诱导腹腔淋巴细胞（ＰＥＬ）。对ｍＩＬ－２＾＋Ｂ１６及其亲代Ｂ１６细胞在不同天数内诱导的ＰＥＬ的数量、ＰＥＬ组成成分、对靶细胞的杀伤百分率等几个方面的特点进行了动态分析和比较，结果显示：不同诱导天数的ＰＥＬ之间，以上三个特点存在明显的动态变化规律，而ｍＩＬ－２＾＋Ｂ１６了Ｂ１６的ＰＥＬ之间的这种动态变化又存     

用合成肽替代肿瘤抗原诱导肿瘤特异性T杀伤细胞的研究

利用海绵移植模型，将Ｆｆｉｅｎｄ病毒ｇａｇ基因编码蛋白的两个合成肽片段分别注入海绵中，植入Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２）小鼠皮下，经一定潜伏期后收集其中的浸润淋巴细胞（ｓｐｏｎｇｅｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＳＩＬｓ）体外培养扩增后，发现合成肽３号能诱导出针对该合成肽特异性的ＳＩＬｓ，并特异性杀伤用合成肽３号致鳘的Ｅ１０靶细胞，但不杀伤Ｆｒｉｅｎｄ病毒在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠诱导的ＦＢＬ－     

IL－12对肿瘤病人PBMC增殖和杀瘤活性的实验研究

主要观察了ＩＬ－１２与ＩＬ－２联合对健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ增殖和体外杀瘤活性的影响。实验结果表明，单独应用ＩＬ－１０２对肿瘤病人ＰＨＡ活化ＰＢＭＣ增殖活性很小，如与低剂量ＩＬ－２合用，则可明显促进其增殖效应，表明ＩＬ－２可增强ＩＬ－１２的作用。与单用ＩＬ－１２相比，当ＩＬ－１２与低浓度ＩＬ－２合用时，健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ对Ｋ５６２细胞和Ｒａｊｉ细胞的杀伤活性均明显增强，且对Ｋ５６２细胞株杀伤活性明显强于对Ｒａｊｉ细胞株的杀伤活性。上述结果表明，ＩＬ－１２与ＩＬ－２合用对健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ增殖及杀瘤活性影响的格局基本一致。本实验为进一步研究ＩＬ－１２协同其它因子增强肿瘤病人ＬＭ和ＴＩＬ等免疫细胞抗肿瘤效应并进而使ＩＬ－１２过渡到临床肿瘤病人治疗提供了重要的实验依据。     

IL—12对肿瘤病人PBMC增殖和杀瘤活性的实验研究

主要观察了ＩＬ－１２与ＩＬ－２联合对健康人和肿瘤病人ＰＢＭＣ增殖和体外杀瘤活性的影响，实验结果表明，单独应用ＩＬ－１２对肿瘤病人ＰＨＡ活化ＰＢＭＣ增殖活性很小，如与低剂量ＩＬ－２合用，则可明显促进其增殖效应，表明ＩＬ－２可增强ＩＬ－２的作用，与单用ＩＬ－１２相比，当ＩＬ－１２与低浓度ＩＬ－２合用时，健康和肿瘤病人ＰＢＭＣ对Ｋ５６２细胞和Ｒａｊｉ细胞杀伤活性活性明显增强，且对Ｋ５６２细胞株杀伤活性明     

MHC－I类分子在诱导肿瘤浸润淋巴细胞细胞毒活性中的作用

选用Ｈ＿２２（小鼠肝癌）、Ｂ＿１６（小鼠黑色素瘤）和Ｅ＿（１０）（小鼠淋巴瘤）三种动物模型分离肿瘤浸润淋巴细胞（ＴｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＴＩＬｓ），在含ＩＬ－２２００Ｕ／ｍｌ的培养系统中以６０钴灭活自身瘤细胞，周期性刺激进行扩增。实验发现，被选用的三种动物瘤株中。仅从Ｅ＿（１０）淋巴瘤分离的ＴＩＬ显示明显的增殖和对自身瘤细胞的杀伤活性。对三种瘤株体外ＭＨＣ限制性观察结果表明，未测出Ｈ＿（２２）、Ｂ＿（１６）瘤株细胞表达Ｋ￣ｂ、Ｄ￣ｂ、Ｋ￣ｋ、Ｄ￣ｋ、Ｋ￣ｄ、Ｄ￣ｄ位点编码的ＭＨＣ－Ｉ类分子，而Ｅ＿（１０）瘤细胞则表达强阳性的Ｋ￣ｂ、Ｄ￣ｂ位点编码的ＭＨＣ－Ｉ类分子。此外，Ｈ＿（２２）、Ｂ＿（１６）瘤细胞可在多种品系（Ｃ＿（５７）ＢＬ／６、Ｃ＿３Ｈ、Ｂａｌｂ／Ｃ及昆明种）小鼠中生长，而Ｅ＿（１０）瘤株只限制在Ｃ＿（５７）ＢＬ／６品系小鼠中生长。     

白介素12增强白介素4基因转染的肿瘤细胞诱导CTL的研究

ＩＬ－１２是一种具有广泛免疫调节作用和抗肿瘤作用的细胞因子研究了ＩＬ－１２对白介素４基因转染的小鼠Ｂ１６黑素瘤细胞（Ｂ１６－ＩＬ－４＾＋）诱导的ＣＴＬ的杀伤活性，ＩＦＮ－γ分泌水平和增殖能力的影响，结果发现ＩＬ－１２能显著增强体外诱导的ＣＴＬ的杀伤活性及提高ＩＦＮ－γ的分泌水平，并能促进ＣＴＬ的增殖，ＩＬ－１２与低剂量的ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）合用能协同增强ＣＴＬ的杀伤活性，ＩＦＮ－γ分泌水平及肿     

IL—2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白增强杀伤细胞活性

实验证实了白细胞介素２－绿脓杆菌外毒素融合蛋白ＩＬ２－ＰＥ４０ＲＥＤＬＫ、ＩＬ２－ＰＥ４０ＫＤＥＬ、ＩＬ２－ＰＥ６６4GluＲＥＤＬＫ、ＩＬ２－ＰＥ６６4GluＫＤＥＬ对含高亲和力ＩＬ－２受体靶细胞的杀伤效应是借助于ＩＬ－２与其受体的特异性结合和ＰＥ的杀伤活性介导的，而且同一靶细胞对这些融合蛋白的敏感性有较大的差异，对人外周血ＰＨＡ体外活化的淋巴母细胞的杀伤活性，ＩＬ２－ｐＥ６６4GluＫＤＥＬ要比ＩＬ２－ＰＥ４０ＲＥＤＬＫ强约４０倍，还发现若将ＩＬ２－ＰＥ融合蛋白羧基末端的ＲＥＤＬＫ氨基酸突变为ＫＤＥＬ可增强其杀伤细胞的活性，对ＣｏｎＡ活化的小鼠脾母细胞的杀伤活性，ＩＬ２－ＰＥ４０ＫＤＥＬ要比ＩＬ２－ｐＥ４０ＲＥＤＬＫ强８倍。     

TNF-α基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

为了探讨两种具有协同作用的细胞因子共转染的瘤苗是否具有更好的抗肿瘤作用，我们将ＴＮＦ－α基因和ＩＬ－２基因转染Ｂ１６黑色素瘤细胞，获得同时分泌ＩＬ－２和ＴＮＦ的Ｂ１６细胞克隆株（命名为Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞），并观察了其体内致瘤性和瘤苗效果。结果发现，Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的体内致瘤性显著低于ＴＮＦ－α基因或ＩＬ－２基因单独转染的Ｂ１６细胞；而且，事先接种Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的小鼠能抵抗再接种的野生型肿瘤细胞的生长，表明其具有更佳的瘤苗效果。     

癌症患者外周血单个核细胞IL—2的诱生及其受体的表达

本文测定了２０例肝癌和２４例乳腺癌患者ＰＢＭＣ自发膜表面白介素２受体（ｍＩＬ－２Ｒ）和ＰＨＡ刺激的ＰＢＭＣ ｍＩＬ－２Ｒ的表达频率，以及ＩＬ－２的诱生水平。结果发现：①癌症患者ＰＨＡ刺激的ＰＢＭＣ ｍＩＬ－２Ｒ的表达频率以及ＩＬ－２的诱生水平显著低于正常人群；②手术后一个月患者ＰＨＡ刺激的ＰＢＭＣ ｍＩＬ－２Ｒ的表达频率和ＩＬ－２的诱生水平有所回升，但仍低于正常人群。结果提示，癌症患者ＰＢＭＣ处于     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

Role of adherence vs. spreading in the induction of membrane-associated interleukin-1 on mouse peritoneal macrophages

Adherence of peritoneal exudate cells (PEC) to plastic has been shown to activate several PEC functions, such as tumor cell lysis and membrane-associated interleukin-1 (mIL-1) expression. Several studies have demonstrated that leukocyte adherence is dependent on divalent cations. In this study, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), a known chelator of divalent cations, was used to evaluate the role of cell attachment vs. spreading in adherence-induced mIL-1 activity on resident C57BL/6 mouse PEC. Significant inhibition of PEC spreading on plastic and mIL-1 expression was noted when PEC were cultured in the presence of 10 mM EDTA. However, PEC remained adherent in the presence of EDTA and were able to express mIL-1 activity in response to a soluble stimulus lipopolysaccharide (LPS) 1 microgram/ml. These results suggest that the divalent cation-dependent spreading of PEC on plastic initiates or enhances the expression of mIL-1 activity. Additionally, adhesion and LPS stimulate mIL-1 expression by independent mechanisms.     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性

目的：获得表达小鼠IL-23(mIL-23)基因的小鼠结肠癌细胞株。方法：应用逆转录病毒载体，将mIL-23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26，经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆(Colon26／IL-23)。用PCR和RT—PCR检测目的基因的表达，用ELISA法检测mIL-23的产生及mIL-23诱导的小鼠脾细胞IFN-γ的产生，用MTT比色法检测Colon26／IL-23细胞和Colon26细胞的体外增殖，将Colon26／IL-23细胞接种于BALB／c小鼠的右侧背部皮下，观察其致瘤性结果：建立了可表达mIL-23基因的小鼠结肠癌细胞株。分泌至培养上清中的IL-23，可诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ在体外Colon26／IL-23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同，但其在体内的致瘤性下降，具有抗瘤作用。结论：Colon6／IL-23细胞可分泌IL-23并证明其具有抗瘤活性。     

Preliminary study on mouse interleukin-21 application in tumor gene therapy

lnterleukin-21(IL-21)is a recently characterized T cell-derived cytokine with a significant homology to IL-2,IL-4 and IL-15.To determine whether IL-21 has broad immunoregulatory activity and can stimulate durableantitumour responses,we constructed mouse IL-21(mIL-21) recombinant plasmid and evaluated its antitumorefficacy.Mouse IL-21 cDNA was amplified from Con A-activated mouse T cells by RT-PCR.RecombinantpcDNA3.1/mIL-21 was constructed and transfected into Sp2/0 cells.Mouse IL-21 expression was analyzed byWestern blotting and its activities were detected by ~3H-TdR incorporation and MTT assay.The recombinantpcDNA3.1/mIL-21 was injected s.c.into tumor lump.Tumor size,weight,the activities of CTLs,NK cells andLAK cells and serum IFN-γ,level were measured for evaluating mIL-21 mediated antitumor responses.Theresults indicated that mIL-21 was correctly expressed in Sp2/0 cells and it can improve the proliferation of Tcells and B cells,and enhance NK cytotoxic activity in vitro.The activities of CTL and NK cells,and serumIFN-γlevel were significantly improved,furthermore the tumor growth was obviously suppressed inpcDNA3.1/mIL-21 treated mice.However,the LAK activity did not alter significantly.Taken together,thisstudy suggests that the injection with recombinant plasmid containing mIL-21 is a potential approach fortumor gene therapy.Cellular & Molecular Immunology.2004;1(6):461-466.     

Induction of autoantibodies against mouse soluble proteins after immunization with living cells presenting the autoantigen at the cell surface in fusion with a human type 2 transmembrane protein

Induction of autoantibodies towards immune regulatory proteins, such as cytokines or their receptors, is a powerful strategy for functional studies on the role of these factors in vivo. Here we describe a new procedure to elicit autoantibodies by taking advantage of tumor cells as a vaccine against peptides presented at their surface in fusion with the human CD134L transmembrane protein. P1.HTR, an immunogenic variant of the P815 mastocytoma cell line, was used to generate stably transfected cell clones with expression vectors encoding the human CD134L transmembrane protein fused with either mouse IL-22BP or IL-9. Following repeated injections of living tumor cells expressing the mIL-22BP construct, mice developed autoantibodies that bind to mIL-22BP and inhibit its interaction with IL-22 in vitro. Mice similarly immunized against mIL-9 produced high titers of autoantibodies that block the activity of this cytokine in the TS1 bioassay. This procedure also inhibits IL-9 activity in vivo as no increase of serum MMCP-1 mast cell protease concentration was observed following IL-9 administration to immunized mice. As an alternative to the injection of living tumor cells expressing the CD134L-antigen fusion protein, intramuscular electrotransfer of the corresponding DNA construct also induced autoantibodies. These results validate this method as a simple and convenient approach to knock down the in vivo activity of soluble regulatory proteins, including cytokines and their receptors.     

小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究

目的 克隆小鼠白细胞介素－１８（ＩＬ－１８）编码区的ｃＤＮＡ,并实现在真核细胞中的表达。方法 用小鼠白细胞介素 －１８（ｍＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ核苷酸序列,设计、合成基因序列特异性引物,应用逆转录多聚酶链反应ＲＴ－ＰＣＲ,以植物血凝（ＰＨＡ）和细胞脂多糖（ＬＰＳ）刺激的小鼠非粘附性脾细胞的ｍＲＮＡ为模板,扩增获得全长ｍＩＬ－１８,转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２,并进行ＩＬ－１８生物学活性的检测。结果     

小鼠IL－3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３的克隆，将可分泌ＩＬ－３的细胞种植到放射损伤小鼠体内后发现：受体小鼠血清中检出了ＩＬ－３的活性；其外周血白细胞计数升至５５万／ｍｍ３，以成熟中性粒细胞为主；肝、脾脏内有大量各个分化阶段的中性粒细胞。这些结果表明：可以利用基因治疗技术，在体内表达ＩＬ－３，改善机体的造血功能。     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。