电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变

背景:目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察.目的:采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点.设计、时间及地点:观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成.材料:成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供.Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜.方法:从新西兰大白兔骼后上嵴处抽取骨髓.经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C.培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测.主要观察指标:光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点.结果:培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果.经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应.光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列.透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.结论:骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭.目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成.材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160 g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代.重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品.方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2:音猬因子组:加入20 μg/L音猬因子:联合组:100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞:对照组:不加任何干预措施.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异.结果:①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形.条件培养基培养3 d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形.随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变.②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05).联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05).③间充质干细胞经诱导培养7 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性.诱导培养14 d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组入骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳.矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节.④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近.结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化成骨细胞的潜能。方法采用Perco密度梯度离心和贴壁细胞法对MSCs进行分离培养,并观察其形态学特征。在诱导剂诱导作用下,通过形态学观察,采用免疫组化法检测细胞CD44,CD54表型,钙钴法检测ALP活性,Von-Kossa法矿化结节染色,RT-PCR扩增成骨细胞中CBFA I基因表达。结果采用Perco分离的MSCs,CD44,CD54表达阳性,经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,ALP合成增多,活性增加,Von-Kossa法矿化结节染色阳性,RT-PCR扩增出165bp CBFA I基因转录片段。结论体外分离纯化培养的MSCs经成骨诱导剂诱导后能向成骨细胞方向分化增殖。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。目的:探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养)72h,其后换用普通培养基继续培养4周。结果与结论:初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT、desmin、α-sarcomericactin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨分化

背景: 目前成人骨髓间充质干细胞体外培养成骨定向分化的研究较多,甚少见有不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨定向分化生物学特性差异的报道.目的: 研究不同年龄儿童骨髓间充质干细胞的自体血清体外培养条件与方法,并探讨其成骨诱导分化后的基本生物学特性.方法: 无菌条件下收集3个不同年龄组儿童骨髓悬液,分离人骨髓间充质干细胞,采用含自体血清的培养基培养;测定细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原;取传代培养细胞,经β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松进行成骨诱导分化后,采用免疫组织化学法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原以及钙结节形成,以评价其分化效率;倒置相差显微镜逐日观察原代、传代及诱导分化细胞的生长情况及形态学改变.结果与结论: 3组儿童培养的人骨髓间充质干细胞,经刺激培养后细胞表面抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45、CD105、CD106及HLA-DR均为阴性,各组表达强度差异无显著性意义.不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长速度以及分化效率随年龄增大而减小.结果提示通过对不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,自体血清可作为安全有效的培养方法,且年龄越小,分化效率相对越高.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养10d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Vonkossa染色。结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组（P〈0.05）。实验组细胞Vonkossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导为成骨细胞的生物学特征

背景:脊柱和创伤骨科的重建修复对骨的需求量极大,但现实的供需缺点和矛盾限制了植骨运用,急需找寻一种替代途径.目的:探索骨髓间充质干细胞体外分离培养的最佳实验条件,并观察其生物学特征.设计、时间及地点:细胞水平的体外组织工程实验,于2007-05/2008-05在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.材料:选择4周龄雄性新两兰大耳白兔,由苏州大学动物中心提供.方法:自股骨大转子及髓腔抽取新西兰大耳白兔骨髓,采用密度梯度离心法获取离心层骨髓单个核细胞,体外接种连续培养观察,原代接种后48 h首次换液,此后每二三天全量换液;待细胞长至90%汇合时,用胰酶和EDTA混合液消化传代.主要观察指标:采用倒置显微镜下进行细胞生长形态观察,四唑盐比色法测定细胞活性并描绘细胞生长曲线:另选择P3代细胞进行成骨条件培养液培养4周,应用Gomori钙钴染色法鉴定成骨分化的标志物--碱性磷酸酶阳性细胞,应用Von-Kossa 改良染色法测定钙节结.结果:分离培养的骨髓间充质干细胞生长形态和增殖活性良好,接种后的细胞由短梭形向长梭形、三角形乃至多角性发展,各代细胞有明显的生长潜伏期、对数增长期和平台期,细胞可以连续培养至P9代.经成骨诱导分化的细胞碱性磷酸酶染色阳性率为93%,矿化结节染色阳性.结论:骨髓间充质干细胞体外分离、扩增简单可行,可以定向诱导为成骨细胞.     

中药诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：近年来研究显示,中药在诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化起到积极作用。目的：综述中药诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的研究进展。方法：以＂中药,骨髓间充质干细胞,成骨细胞＂为检索词,检索万方医学数据库中2004年1月至2012年4月的文献,纳入中药诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的相关研究,最终入选18篇文章进行总结分析。结果与结论：中药血清药理学认为中药血清既能去除中药内未知的毒性又能反映中药的药效,在上述理论的指导下,许多学者将含补肾、接骨等中药血清应用于诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究。结果显示,这些单味中药、单味药提取物、复方药含药血清均可以促进体外培养的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞,具有安全、使用简便等特点。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景: 人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞.目的: 体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞.方法: 无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理.倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记.诱导后:检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达.结果与结论: 传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44.诱导后von Kossa染色表现为阳性.碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P<0.05),不同时间点比较21 d最高(P<0.05).RT-PCR显示:诱导组21,28d碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P<0.05).诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达.提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-Ⅰ是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 设计：开放性实验。 单位：中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。 材料：实验于2003-03／11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。 方法：采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞，体外扩增，用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44，CD71，CD34, CD45表达；在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg／L胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液，采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。 主要观察指标：通过检测细胞CD34，CD44，CD45的表达，进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。 结果：①倒置显微镜观察结果：体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45，说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点：③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化：加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-Ⅰ共培养，在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆，15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形．突起短，呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72．5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内，呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液共培养组培养15d后，细胞内蛋白多糖含量为[8．92&;#177;0．91）μg／L，高于单纯骨髓间充质干细胞培养组Ⅰ（2．56&;#177;0．26）μg／L，P〈0．05]，但低于软骨细胞组[（13．69&;#177;1．51）μg／L，P〈0．05]。 结论：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的:以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2002-12/2003-08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,观察细胞增殖情况,作出生长曲线。分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性,并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色,观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果:微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值,并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P>0.05)。结论:应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增,可以满足骨组织工程量和质的需要。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的可行性研究

目的:探索和建立人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs)体外分离和培养的技术方法,鉴定其生物学特性,为进一步建立基因工程细胞做准备。方法:采用低糖DMEM培养液加100mL/L胎牛血清体外培养BM-MSCs,描记生长曲线;流式细胞仪分析BM-MSCs的表面标记。结果:BM-MSCs为单层贴壁生长,成规则的集束辐射状排列;表达CD13,CD29,CD59,不表达CD11,CD14,CD31,CD34,CD45,CD80,CD86,CD117,HLA-DR;采用脂质体介导方法,以pEGFP-N1质粒转染BM-MSCs。结论:该培养条件能获得大量高度均一的BM-MSCs;传代后的BM-MSCs有相同的生物学特性,以脂质体介导进行的pEGFP-N1基因转染具有可行性。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

目的诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，将其分为对照组和诱导组两组。诱导组加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导成骨。采用免疫荧光染色的方法检测碱性磷酸酶（AKP）和骨桥蛋白（0PN）的表达；并通过RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA的表达；利用硝酸银染色和茜素红染色两种特殊染色方法检测钙盐沉积。结果经诱导，诱导组细胞在呈典型的成骨细胞形态并有钙结节形成；免疫荧光染色结果显示诱导组细胞AKP和OPN均为强阳性表达，RT-PCR结果也显示诱导组细胞骨桥蛋白mRNA表达；两种特殊染色结果显示诱导组细胞有大量的钙盐沉积。而对照组细胞无上述形态改变和表达。结论人骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能向成骨细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的:分离培养人骨髓间充质干细胞,研究其在体外生长增殖的生物特性。方法:冲洗手术弃骨骨髓,获取骨髓间充质干细胞进行培养,倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原,进行染色体核型分析。观察冷冻保存细胞复苏后的生长状况。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的作用下,进行成骨诱导分化。结果:原代和传代培养的细胞呈现梭形外观,具有较强的生长增殖能力;细胞CD44,CD54抗原表达阳性,CD34表达阴性。进行染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。分化细胞表现成骨细胞特性,合成碱性磷酸酶能力增强,矿化结节逐渐出现。结论:建立分离培养人骨髓间充质干细胞和研究其体外培养生物特性的方法,为通过组织工程学方法修复组织损伤奠定基础。