食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立双重荧光PCR用于检测食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌。方法设计特异性引物和探针用于扩增副溶血性弧菌tlh基因和沙门菌invA基因(invA),采用倍比稀释法检测方法的DNA灵敏度和菌液灵敏度,采用9株其他肠道致病菌验证方法的特异性。结果两种病原菌DNA检测灵敏度分别为65 fg/PCR和56 fg/PCR体系,菌液检测灵敏度分别为11 cfu/ml和9 cfu/ml,特异度100%。用建立的方法对4起食物中毒进行检测,共检出副溶血性弧菌15株和沙门菌8株。结论该方法高效并具有很高的灵敏性和特异性,在副溶血性弧菌和沙门菌引起的食物中毒的快速检测中具有广阔的应用前景。     

基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中的沙门菌

目的:建立基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中沙门菌的检测体系。方法:根据沙门菌外膜蛋白Ompc基因的保守序列,设计1对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应体系和反应条件进行优化。利用建立的检测方法对舟山水产品加工厂和舟山菜市场采集的120份样本进行检测。结果:该检测方法可以达到1μl 1.0×101拷贝数量级的灵敏度。样品检出率为10.0%,与国标法检测结果一致。结论:本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简便快速的实现对水产品中沙门菌的检测。     

基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌

目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌(salmonella,Sa)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)的方法。方法根据沙门菌aceA基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5′端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR检测沙门菌的方法。结果 29种不同血清型沙门菌均扩增出aceA基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。aceA、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR扩增效率分别为89%、87%、90%,最低检测浓度分别达到280cfu/ml、260cfu/ml、300cfu/ml。结论本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测。     

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测脑膜炎奈瑟菌porA基因

[目的]建立一种特异、灵敏、快速检测脑膜炎奈瑟苗的宾时荧光PCR方法.[方法]针对脑膜炎奈瑟菌特异性基因porA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析;用建立的检测方法与常规PCR方法的检测结果做对比.[结果]应用该实时荧光PCR方法,64侏脑膜炎奈瑟菌检测结果均为阳性,6株非脑膜炎奈瑟菌结果均为阴性:检测灵敏度达5.0×103 cfu/ml,即5cfu/test,比常规PCR方法灵敏度高10倍;该方法重复性好.[结论]实时荧光PCR方法检测脑膜炎奈瑟菌具有灵敏、特异、快速方便的特点,可用于定量检测.     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌

[目的]建立荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速方法。[方法]根据基因库公布的副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因（TDH）的保守序列,设计一对引物,用FAM荧光剂标记探针的5＇,进行特异性和灵敏性分析,使用于食物中毒样品的快速检测。[结果]检测灵敏度为170.8fg/μl,菌液的灵敏度为30~70cfu/ml。用此反应体系检测53株副溶血性弧菌均出现特异的荧光信号,未见与其它试验种属细菌交叉。对3起食物中毒样品45份用荧光PCR法和国标法检测副溶血性弧菌,荧光PCR检测阳性22份,国标法阳性20份。荧光PCR检测从样品处理到结果只需8h。[结论]荧光PCR检测副溶血性弧菌灵敏度高、特异性强、简便快速,可用于副溶血性弧菌引起食物中毒的快速诊断和海产品副溶血性弧菌的快速检测。     

Real-Time PCR探针法检测食物中毒中沙门菌方法建立及应用

目的:建立食物中毒中沙门菌Real-Time PCR检测方法并将其应用。方法:选取沙门菌侵袭蛋白A基因(in-vA)进行引物和探针设计,并对反应条件不断优化,进行灵敏度和特异度测试,建立检测沙门菌的Real-Time PCR方法。结果:DNA灵敏度检测沙门菌达到56 fg/PCR体系,菌液灵敏度检测沙门菌达到9 CFU/ml,特异度100%。用建立的方法对四起食物中毒、2000份健康从业人员体检肛拭样品、80份食品监测样品进行了检测,共检出沙门菌15株。结论:该方法具有高灵敏性和高特异性的特点,可以应用在沙门菌引起的食物中毒的快速检测中。     

应用PCR技术快速检测沙门菌

[目的]建立用于快速和特异检测沙门菌的PCR方法。[方法]将受试菌种按煮沸裂解法提取DNA,针对hns与invA基因序列合成2对PCR引物,对沙门菌标准菌株和其他菌属的菌株进行PCR检测,并用福建省2006—2007年沙门菌临床分离株137株进行验证。[结果]沙门菌标准菌株hns和invA基因均为阳性;137株沙门菌临床分离株hns和invA基因的阳性率分别为100％和99．3％,其他菌属的菌株无特异性条带。[结论]本研究建立的PCR方法可用于检测沙门菌属。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

饮用水大肠菌群Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法研究

[目的]建立快速、灵敏、特异的饮用水大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法.[方法]以大肠菌群的lacZ基因为检测靶基因,设计荧光定量PER引物和Taqman-MGB探针,建立荧光定量PER定量反应体系,并评价荧光定量PER方法的灵敏度、特异性、重复性.[结果]建立大肠菌群的荧光定量PER检测方法.25μl荧光定量PER反应体系主要成分浓度分别为Mg2+5.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L,探针0.5μmol/L,4xROX参比荧光染料0.5μl,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板5μl.方法可检出每微升单个拷贝大肠菌群模板,方法的特异性、重复性良好.[结论]荧光定量PER方法可快速、灵敏、特异地检出水质中大肠菌群,可为饮用水大肠菌群快速检测标准方法的建立提供参考.     

Specific detection of Salmonella enterica serotype Enteritidis using the polymerase chain reaction.

An assay was developed for the specific detection of Salmonella enterica serotype Enteritidis, using a novel application of the polymerase chain reaction (PCR). This PCR assay is based on the mismatch amplification mutation assay, an allele-specific reaction, and can discriminate Enteritidis from all other salmonella. PCR primers were selected to amplify a 351-base pair (bp) DNA fragment from the salmonella plasmid virulence A (spv A) gene of Enteritidis. A single base difference at position 272 is present between the nucleotide sequence of the spvA gene of Enteritidis and other salmonellae. The downstream PCR primer, that encompasses position 272 of the Enteritidis spvA gene, was designed to contain a single base mismatch at the penultimate position, resulting in a 1-base mismatch with Enteritidis and a 2-base mismatch with other salmonellae that harbour the virulence plasmid. The upstream primer was completely homologous with the region immediately 5'' to the spvA gene. When these primers were used and the annealing and extension reactions were performed at the same temperature, the PCR assay was specific for Enteritidis; no PCR product was detected for 40 other serotypes and 28 different genera examined. In pure culture, 120 colony forming units (c.f.u.) could be detected; a PCR product was observed from template derived from a 5 h enrichment broth culture of chicken seeded with 1 c.f.u. per gram of Enteritidis. This PCR assay is specific, reproducible, and less time consuming than the standard bacteriological methods used to detect Enteritidis.     

食品中产气荚膜梭菌α毒素基因快速检测方法的研究

目的建立分子信标荧光PCR体系检测产气荚膜梭菌的快速检测方法,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检验。方法根据GenBank公布的保守序列,针对α毒素基因设计一对引物和分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,并进行特异性和灵敏度分析,同时以10种细菌作对照。结果分子信标荧光PCR反应体系检测10种细菌,只有产气荚膜梭菌出现特异荧光信号,其他均无荧光信号,而且与其他细菌无交叉反应。对40份食品样品进行检测,3份产气荚膜梭菌PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2 h。3份阳性样本经传统方法培养,2份有检出产气荚膜梭菌。结论分子信标荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于产气荚膜梭菌食物中毒的快速诊断和食品污染物及感染性腹泻等监测工作中,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

TaqMan MGB探针检测HBV DNA C区双突变方法的建立

目的建立简便、灵敏的HBV DNA C区序列中核心启动子（BCP）双突变的检测方法。方法采用Taq-Man MGB探针技术进行双突变的检测,首先根据双突变的序列设计FAM荧光标记的TaqMan MGB探针和配套的引物,对标准阳性对照和标准阴性对照进行扩增检测,确定灵敏度和特异性,然后对临床HBV DNA阳性血清进行扩增检测,并通过PCR产物直接测序验证所建立方法检测结果的准确性。结果该方法检测出HBVDNA BCP双突变序列的灵敏度为3×10^0拷贝/ml的模板,并且可以稳定地从1×10^3拷贝/ml标准阴性对照中检测出1×10^1拷贝/ml的标准阳性对照。结论该技术适用于临床检测血清中HBV DNA C区BCP双突变。     

单细胞的DOP—PCR—CGH分析

为探索退变寡核甘酸引物多聚酶链反应(DOP-PCR)比较基因组杂交(CGH)单细胞基因组研究的可能性,用DOP-PCR扩增正常XX、XY,异常XO、XXY、13三体和21三体单个细胞基因组DNA,经萤光标记后,分别以正常男性基因组DNA和正常男性单个淋巴细胞DOP—PCR产物为参照,进行CGH分析。结果以基因组DNA为参照的CGH双色荧光强度比均数波动围大,约30％区域的标准差超过正常允许范围,X染色体呈假性过度表达,未能检出13,21三体。以单细胞DOP-PCR产物为参照的CGH强度比均数接近期望值1.0,仅6％的标准差超出正常波动范围,13和21三体的相应染色体大部分常染色质区过度表达。结论:单细胞DOP-PCR存在非随机的不均匀扩增,其对CGH的影响,能通过应用单细胞DOP-PCR产物为参照而得以纠正。单细胞DOP-PCR-CGH及其用于着床前胚胎及母体血胎儿单细胞全基因组研究具有可能性。     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

A quantitative polymerase chain reaction method for the detection in avian faeces of salmonellas carrying the spvR gene.

A quick, semi-quantitative method of detecting Salmonella species which contain the virulence plasmid has been developed using the polymerase chain reaction (PCR). A pair of primers have been synthesized encompassing a 500 bp fragment of the spvR virulence gene. Competitor DNA consisting of the spvR gene with a 94 bp deletion situated between the primer recognition sequences, was cloned into a plasmid vector. Co-amplification of the ''unknown'' target salmonella DNA with known quantities of competitor DNA in the same reaction tube gave PCR products of 500 and 406 bp respectively. Visual assessment of the ratio of the two products on ethidium bromide stained agarose gels provided an estimate of the approximate number of salmonella cells present in avian faeces. The technique could be applied to detect quantifiably any non-host DNA in clinical samples if a suitable DNA sequence for primer construction is available.     

PCR方法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌

目的建立聚合酶链反应(PCR)方法快速检测牛奶、冰淇淋及肉中的金黄色葡萄球菌(金葡菌)。方法针对金葡菌耐热核酸酶基因(nuc)、纤维蛋白原结合蛋白基因(ClfA)设计并合成2对引物进行PCR扩增,特异的检测金葡菌,并对52株金葡菌和31株非金葡菌进行扩增,验证方法的特异性。在牛奶、冰淇淋及肉中人工污染不同菌量,增菌培养,在不同时间段提取DNA进行PCR扩增,确定该方法在食品中的检出限。结果nuc、ClfA两对引物对金葡菌的检出均有很好的特异性,在3种食品中的检出限均为10cfu/g(ml),全部检测可在24h完成。结论建立了适用于牛奶、冰淇淋及肉中的金葡菌检测的快速、灵敏、特异的PCR方法。     

荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

目的 建立Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法.方法 针对肺炎链球菌自溶素基因设计引物及探针,建立荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链球菌感染.采用肺炎链球菌标准株,构建质粒,用质粒构建标准品,扩增标准品,绘制标准曲线并检验新建荧光定量PCR的敏感性,采用本实验冻存其他菌DNA样本,检测其特异性;采集2015年9月至2015年12月份北京地区家5家医院儿童门诊或病房,诊断为呼吸道感染患儿的咽拭子标本133例,对新建荧光定量PCR法进行临床样本的验证.结果 绘制了荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链菌感染的标准曲线;新建荧光定量PCR可检测的肺炎链球菌最低拷贝数为10copies/μL;新建荧光定量PCR可成功区分几种病原体DNA,具有较好特异性;采用新建荧光定量PCR检测临床样本132例,其中肺炎链球菌阳性25例,阳性率为18.94%.结论 新建立的荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床样本的检验.     

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。