曲安奈德对缺氧条件下恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞VEGF表达的影响

目的:研究曲安奈德对缺氧条件下恒河猴视网膜脉络膜内皮细胞VEGF表达的影响,探讨曲安奈德治疗视网膜脉络膜新生血管的作用机制。方法:采用免疫组化图像分析和半定量RT-PCR方法,检测曲安奈德对正常和缺氧条件下RF/6A细胞VEGF表达的影响。结果:缺氧条件下VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显增强,加入曲安奈德后VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显减弱,正常条件下的VEGF蛋白的A值为276.8±8.6;正常加药组的A值为137.1±10.2;缺氧条件下的A值为406.1±8.8;缺氧加药组的OD值244.2±12.8。半定量RT-PCR表明VEGFmRNA在正常对照组RF/6A细胞中的相对表达量为1.38±0.05;缺氧对照组RF/6A细胞中的相对表达量为5.41±0.06;正常加药组RF/6A细胞中的相对表达量为0.70±0.06;缺氧加药组RF/6A细胞中的相对表达量为4.23±0.05,以上两种方法,缺氧对照组与正常对照组比较、缺氧对照组与缺氧加药组比较、正常对照组与正常加药组比较差异均有显著性意义(P=0.000)。结论:缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达明显增高,曲安奈德能显著抑制正常和缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达。     

整合素连接激酶与缺氧状态下VEGF表达的实验研究

目的探讨缺氧状态下整合素连接激酶(ILK)的表达是否增高以及这种增高与血管内皮生长因子(VEGF)的表达上调是否相关。方法将恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞(RF/6A)置于94%N2、5%CO2和1%O2的低氧环境,检测0、1、2、3、4hILK,HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达水平,进一步用LY294002抑制ILK的活性或RNA干扰抑制ILK的表达后再次检测缺氧4h上述3种因子的表达情况。结果在缺氧0hILK、HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达均较低,而缺氧1～4hILK、HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达均明显增高,但这种增高都会因为ILK的表达或活性受到抑制而被抑制。结论缺氧状态下在RF/6A细胞中ILK的表达增高,并且ILK的表达增高也会使HIF-1α和VEGF表达上调,说明ILK参与缺氧状态下RF/6A细胞VEGF的表达。     

虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响

目的：观察虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)血管新生作用的影响,探讨其可能的作用机制。
　　方法：培养 RF/6A 细胞,分为正常对照组(NC 组)、高糖对照组(HG 组)、高糖加不同浓度的虫草素组(HG+10μg/ mL组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组)。采用 CCK8法检测各组细胞的增殖活性;采用 Transwell 实验检测各组细胞的迁移;采用 Matrigel 检测各组管腔形成的情况;采用 Western-blot 检测各组细胞中 VEGF 和 VEGFR2蛋白表达的情况。
　　结果：与 NC 组相比,HG 组 RF/6A 的增殖活性增加( P<0.05)。不同浓度的虫草素对 RF/6A 的增殖均有抑制作用,随着虫草素浓度增加,细胞活性下降。 HG+10μg/ mL组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组的增殖活性抑制率分别为(10.2依0.9)%、(23.4依1.5)%、(31.1依1.2)%,与 HG 组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 NC 组、HG组、HG+10μg/ mL 组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组细胞迁移个数分别为55.6依2.70、87.4依2.40、65.4依2.7、57.8依2.38、62.4依2.77个。与 NC 组相比,HG 组迁移细胞数量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞迁移数量随着虫草素浓度的增加而减少,与 HG 组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。 NC 组、HG 组、HG+10μg/ mL 组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组的细胞管腔形成个数分别为18.7依2.08、25.7依1.52、19.9依1.57、16.3依2.51、5.7依1.72个。与 NC 组相比,HG 组细胞管腔形成个数增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞管腔形成个数随着虫草素浓度的增加而减少,与 HG 组相比,差异具有统计学意义( P <0.05)。与 NC 组相比, HG 组 VEGF 和VEGFR2蛋白表达的量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组中细胞内 VEGF 和 VEGFR2蛋白表达的量均低于高糖对照组(P<0.05)。
　　结论：虫草素可能通过抑制高糖下 VEGF 和 VEGFR2蛋白的表达,抑制 RF/6A 细胞增殖、迁移和管腔形成,进而抑制血管新生。     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响

目的 探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响.方法 采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养.通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定.实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15 mmol·L-1、30 mmol·L-1、45 mmol·L-1.分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5 mmol·L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液.观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况.采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24 h、48 h、72 h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化.结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长.在缺氧和高糖培养条件下培养24 h、48 h、72 h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100 μmol·L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol·L-1时,VEGF和TGF-β1在24 h、48 h、72 h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48 h表达量分别为(43.28±0.88)ng·L-1和(8.90±1.38)ng·L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng·L-1和(8.81±0.92)ng·L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48 h达到高峰,而高糖组在72 h达到高峰.结论 应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量.     

缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响

目的:观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)对体外大鼠Müller细胞的影响.方法:体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞.台盼兰染色测定细胞活性.应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间(0～24 h)、添加不同浓度VEGF(10～100μg/L)及VEGF受体FIk-1阻断剂SU1498处理后,细胞中VEGF和FIk-1,FIt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化.结果:纯化培养至第3代的Müller细胞,经鉴定其纯度为90%,活力是87.3%.缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白(GFAP)染色增强,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,可见细胞肿胀、脱落.缺氧20h时,与对照组相比,细胞增生降低到79.3%,细胞凋亡指数增加了6.5倍.缺氧24h前加入75μg/L VEGF使细胞活性增强了1.3倍,凋亡指数下降到2/3.VEGF在10～75μg/L 范围内此作用呈剂量依赖性.正常情况下,FIk-1,FIt-1表达很少,但是缺氧后,表达量明显上升,FIt-1更显著.加入SU1498后能部分抑制VEGF对Müller细胞的作用.结论:短时间缺氧使Müller细胞反应性增生,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,外源性VEGF可能部分地借助于受体FIk-1和FIt-1对缺氧的Müller细胞起到保护作用.     

抗血管生成作用的VEGFxxxb在缺氧视网膜色素上皮细胞中的表达

背景 缺氧可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌血管内皮生长因子A（VEGF-A）,从而促进脉络膜新生血管（CNV）形成.VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成具有促血管生成作用的VEGFxxx和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb,但后者在常氧和缺氧状态下在人RPE细胞中的表达变化及其作用尚不清楚.目的 从mRNA水平和蛋白水平检测模拟缺氧状态培养的RPE细胞中VEGFmb的表达,研究VEGFxxxb在常氧和缺氧培养的RPE细胞中的表达变化.方法 以人RPE细胞系ARPE-19为研究对象,将150 μmol/L化学诱导剂CoC12加入细胞培养液制备缺氧细胞模型,分别于0h（常氧培养）及缺氧培养3、6、12和24 h收获细胞或细胞上清液,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞内VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞内总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的表达;采用ELISA法检测细胞上清中总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的含量.结果 在常氧及诱导缺氧后,ARPE-19细胞中均可检测到VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达,检测出的VEGFxxxmRNA中同时出现VEGF121、VEGF165和极微弱的VEGF189条带;检出的VEGFxxxb mRNA中可见VEGF165b条带.缺氧培养的细胞中随着缺氧时间的延长,VEGFxxxmRNA显示出表达逐渐增加的趋势,而VEGFxxxb mRNA则显示出表达逐渐减少的趋势.Western blot法可检测到细胞中VEGFxxxb蛋白的表达,尤以VEGF165b表达最强,随缺氧培养时间的延长,VEGF165b蛋白表达逐渐减少.培养的细胞上清中VEGFxxxb蛋白质量浓度由常氧培养时的（166.82±2.55） pg/ml下降至缺氧培养24 h的（125.35±2.10）pg/ml,而总VEGF-A蛋白则由（294.27±11.97） pg/ml上升至（582.26±12.98） pg/ml.细胞中VEGFxxxbb蛋白占总VEGF-A蛋白的比例随缺氧培养时间的延长,由常氧培养条件下的（56.71±1.02）％逐渐下降至缺氧培养24 h的（21.53±0.08）％.结论 ARPE-19细胞在常氧和缺氧培养条件下均可检测到VEGFxxxbb mRNA和蛋白的?     

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响

目的:观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响,初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法:采用细胞划痕实验测定tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下RF/6A细胞(恒河猴视网膜微血管内皮细胞)迁移的影响;Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。结果:Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用,呈剂量依赖性。正常情况下,RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达,但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达(加入20mg/LT8肽30,45,60min时蛋白表达受到显著抑制,差异有显著性意义,P<0.01)。结论:Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与P38MAPK通路有关。     

视网膜色素上皮细胞培养基筛选及其相关生长因子的影响(英文)

目的:通过研究肿瘤坏死因子(TNF-α),血管内皮生长因子(VEGF)、β成纤维细胞生长因子(βFGF)、转移生长因子β2(TGFβ2)、干扰素-γ(IFN-γ)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Casepase-3)在不同浓度胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)与胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite,ITS)混合培养基中的表达及其对正常视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长的影响以探索维持正常RPE细胞生长的理想培养基。方法:首先分别在不含RPE细胞和DMEM培养基的20,40,100mL/LFBS和10,20,30g/LITS中检测TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及Casepase-3是否存在。然后取四十只C57BL/6系小鼠眼的RPE细胞分别培养于含20,40,100mL/LFBS以及20,40,100mL/LFBS与10g/LITS分别组合的DMEM培养基中。免疫组织化学染色以及细胞计数鉴定、评估RPE细胞的存在与生长状况。采用原代培养48h的第三代、第四代RPE细胞,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及酶联免疫吸附(ELISA)法检测RPE细胞和上清液中TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及casepase-3的表达强弱;用蛋白印记(Western blotting)法检测RPE细胞中Casepase-3的表达。结果:在20,40,100mL/LFBS中检测到了TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3(IFN-γ没有表达)并且随浓度增加而表达上调。在10,20,30g/LITS中没有检测到上述生长因子。RPE细胞培养成功。在含20,40,100mL/L不同浓度的FBS以及20,40,100mL/LFBS与10g/LITS分别组合的DMEM培养基中随浓度增加,TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达呈上调趋势,各对应组组间的表达强度没有明显差异,但不同浓度组组内的表达强度有明显差异(P<0.01)。IFN-γ没有表达。上述因子在含20mL/LFBS与20mL/LFBS+10g/LITS的培养基中表达最低,但20mL/LFBS+10g/LITS的培养基中RPE细胞生长良好。结论:在RPE细胞和上清液中有TNF-α,VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达。20mL/LFBS+10g/LITS的混合培养基可能是维持正常RPE细胞生长的一种理想培养基。     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

缺氧条件下高糖及高胰岛素对Mller细胞VEGF表达的影响

目的观察缺氧、高糖及高胰岛素对视网膜Muller细胞胞浆内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用组织块悬浮贴壁法原代培养兔视网膜Miiller细胞,于正常和缺氧条件下分别分为对照组、高糖组、高浓度胰岛素组、高糖高浓度胰岛素组,通过AO／EB染色法观察不同缺氧时相Mtiller细胞的凋亡情况,免疫细胞化学染色测定各组Mailer细胞胞浆内VEGF的表达。结果免疫细胞化学技术测定结果显示缺氧条件下1、2、3d各实验组与对照组相比VEGF表达量增加差异均有统计学意义（P〈0．05）。缺氧2d、3d各实验组与正常条件下各实验组相比VEGF表达增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论缺氧条件下高糖及高胰岛素环境刺激Mtiller细胞VEGF表达作用增强。     

放射性视网膜病变大鼠玻璃体与血清血管内皮生长因子的相关研究

目的通过放射性^60Co照射SD大鼠制作放射性视网膜病变（RR）模型,探讨在RR的发展中,血管内皮生长因子（VEGF）的作用。方法45只SD大鼠,随机分为正常对照组、10Gy组和30Gy组,每组15只。^60Co射线照射制作RR模型。分别于3、6、9个月时检测RR大鼠血清及玻璃体中的VEGF质量浓度,并制作大鼠视网膜毛细血管铺片。结果30Gy组与10Gy组大鼠玻璃体中VEGF浓度较正常对照组增高,差异均有统计学意义（P〈0.01）。30Gy组与10Gy组大鼠血清中VEGF质量浓度与正常对照组比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。实验组大鼠视网膜毛细血管铺片结果显示,随时间延长视网膜微血管病变逐渐加重。结论在RR大鼠模型中,VEGF参与RR的发展。随时间延长玻璃体中VEGF质量浓度增加,后者与RR视网膜微血管病变的发展呈正相关,为临床上治疗RR提供理论依据。     

靶向血管内皮生长因子的RNA干扰抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管生成的研究

目的探讨玻璃体腔注射靶向血管内皮生长因子（VEGF）的RNA干扰慢病毒抑制氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管生成的作用及其机制。方法实验研究。构建4对针对靶基冈小鼠VEGF的siRNA干扰载体,筛选并进行慢病毒包装。60只C57Bif6J小鼠分成4组（每组15只）：正常对照组．OIR模型组,OIR＋空载体组,OIR＋VEGF-RNA干扰组。OIR＋空载体组和OIR＋VEGF-RNA干扰慢病毒组的小鼠在生后第5天玻璃体腔注射相应的1μ1的7.5×10^7空载体慢病毒和VEGF-RNA干扰慢病毒。后3组小鼠在生后第7天建立OIR模型。第17天时FITC-Dextran灌注视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态及面积变化,视网膜铺片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin的分布变化．Westernblot检测VEGF、磷酸肌醇3激酶（P13K）、酪氨酸蛋白激酶SRC、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）蛋白表达量的变化。数据采用单因素方差分析进行比较。结果FITC-Dextran灌注视网膜铺片显示正常组视网膜血管分布呈均匀网状;RNA干扰组新生血管面积（0．271399mm^2）明显较OIR模型组（1.212782mm^2）、空载体组（1．152504mm^2）少（F=449．924,P〈0．01）。OIR模型组和空载体组间差异无统计学意义,其余两两间差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜铺片免疫荧光染色显示紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin在RNA干扰组中与正常组相似,呈均匀光滑线性分布,而在OIR模型组、空载体组的分布中断、不均匀,在新生血管团中可见团块状的强荧光;VEGF的RNA干扰组中VEGF、P13K、酪氨酸蛋白激酶SRC和p-ERK的蛋白表达量较OIR模型和空载体组低。结论玻璃体腔注射靶向VEGF的RNA干扰慢病毒能有效抑制OIR小鼠模型中VEGF及其下游通路蛋白的表达．从而抑制视网膜新生血管的形成．为临床上早产儿视网膜病变的防治提供了新思路和新途径。     

HIF-1α特异性双链RNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系

背景 脂质体介导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性双链RNA(dsRNA)能够有效抑制鼠视网膜新生血管,抑制效率与其剂量比相关. 目的 探讨HIF-1αdsRNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系.方法 采用Smith的方法,将出生后7d的C57BL/6J小鼠置于氧舱内,控制氧体积分数为(75±3)％,5d后正常氧环境喂养7d后处死;采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态,鉴定视网膜新生血管模型.将出生后7d的8只小鼠于空气中喂养,为正常组.另51只8日龄小鼠放入(75±3)％的高氧环境中,5d后出舱并随机分为对照组(3只)、空载体组(3只)和基因治疗组,基因治疗组按照剂量比例(脂质体:质粒)亚分为9个组,每组5只.出舱当天空载体组小鼠玻璃体腔内注射空载体pSilencer2.1-U6 hygro,基因治疗组按照不同剂量比例注射HIF-1α dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6hygro,均采用脂质体介导.对照组小鼠不作任何处理.注射后7d采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态变化,采用病理切片统计突破内界膜的血管内皮细胞细胞核数,采用免疫组织化学法检测视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异. 结果 视网膜铺片荧光造影发现,正常组视网膜血管分布呈规则均匀的网状结构.对照组和空载体组视网膜血管不规则扩张,中周边部有大量血管新生.基因治疗组中央区视网膜血管迂曲及不规则扩张较对照组和空载体组明显减轻,其中脂质体∶质粒为1∶1组更为明显.病理切片显示,正常组很少见到突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核,而对照组和空载体组中均大量出现,其发生率为100％.各基因治疗组均较对照组的(11.57±5.85)个和空载体组的(11.53±6.15)个明显减少,其中脂质体∶质粒为1∶1组突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核数最少,为(2.17±4.23)个,各治疗组间的差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学染色显示,正常组视网膜中VEGF呈弱阳性表达;对照组和空载体组视网膜中VEGF呈阳性表达.各基因治疗组与对照组和空载体组相比较,VEGF的表达明显减少.结论 采用脂质体介导,玻璃体腔显微注射HIF-1α特异性dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6 hygro能有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成,其中脂质体∶质粒为1∶1时抑制效率最高.     

缺氧条件下Hsp90抑制剂17-AAG对RPE细胞整联蛋白连接激酶表达的影响

目的：研究热休克蛋白（heat shock protein 90,Hsp90）抑制剂17-AAG对缺氧诱导的视网膜色素上皮（ retinal pigment epithelial,RPE）细胞整联蛋白连接激酶（ integrin - linked kinase,ILK）表达的影响。 方法：利用200μmol/L氯化钴（ cobalt chloride, CoCl2）建立体外RPE细胞的化学缺氧模型。不同浓度的Hsp90抑制剂17-AAG预处理RPE细胞1 h后给予12 h缺氧处理。实验分为缺氧对照组、二甲基亚砜（ DMSO）对照组和17-AAG预处理组。其中17-AAG预处理组根据浓度不同又分为6组：0.01,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00μmol/L。应用RT-PCR和Western blot 方法检测ILK表达变化情况。 结果：缺氧对照组、DMSO对照组和17-AAG预处理组ILK mRNA与内参β-actin mRNA 光密度比值分别为1.32±0.04,1.29±0.03,0.93±0.06,0.70±0.05,0.53±0.03,0.44±0.04,0.32±0.04,0.30±0.03;ILK 蛋白与内参β-actin蛋白光密度比值分别为2.16±0.04,2.13±0.04,1.65±0.04,1.13±0.05,0.74±0.03,0.41±0.06,0.35±0.04,0.35±0.03。与缺氧对照组比较,17-AAG预处理组ILK mRNA和蛋白的表达明显降低（ P〈0.05）,呈浓度±赖性。 结论：Hsp90抑制剂17-AAG能够降低缺氧条件下RPE细胞ILK的表达。     

高糖条件下糖康乐对RPE细胞GSH表达的影响

目的探讨在高糖条件下糖康乐对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞谷胱甘肽（GSH）表达的影响。方法采用体外培养的兔RPE细胞,分成空白对照组、高糖组、糖康乐组和牛磺酸组4个实验组（n=6）,在高糖条件下糖康乐组加以不同质量浓度的糖康乐,对RPE细胞的GSH含量进行测定。结果RPE细胞的GSH含量在高糖作用后明显降低（t=5．72,P〈0．01）,糖康乐在质量浓度为2μg／mL时可显著抑制GSH含量的降低（t=4．63,P〈0．01）,在2p．g／mL时其作用优于阳性对照组的牛磺酸（t=4．74,P〈0．01）。结论一定质量浓度的糖康乐可以抑制高糖所导致的RPE细胞GSH含量的降低。     

高山红景天组方对糖尿病鼠视网膜中VEGF表达的影响

目的观察中药高山红景天组方对糖尿病大鼠糖尿病视网膜病变（DR）早期血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立糖尿病大鼠模型。随机分为糖尿病模型治疗组、糖尿病模型未治疗组、正常给药组、正常对照组。造模成功4个月后糖尿病模型治疗组及正常给药组给予高山红景天3g/kg、川芎3g/kg、丹参3g/kg、甘草3g/kg,水煎灌胃,每日1次,正常对照组及糖尿病模型未治疗组均给予凉开水灌胃,每日1次,共1个月。处死大鼠,摘除眼球行VEGF免疫组织化学染色和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量分析VEGFmRNA的表达。结果糖尿病模型未治疗组与正常对照组间大鼠体重、血糖比较差异均有统计学意义（P〈0.01）,糖尿病模型治疗组与正常对照组间大鼠体重、血糖差异均有统计学意义（P〈0.01）。VEGF免疫组织化学染色结果显示,糖尿病模型未治疗组、糖尿病模型治疗组、正常对照组及正常给药组视网膜组织VEGF的蛋白表达积分光密度（IOD）值分别为0.316±0.046、0.149±0.038、0.126±0.028、0.130±0.038;各组面密度（AD）值分别为0.463±0.185、0.121±0.015、0.122±0.007、0.121±0.011。糖尿病模型治疗组与糖尿病模型未治疗组相比、正常对照组与糖尿病模型未治疗组相比IOD值及AL值差异均有统计学意义（P〈0.01）。正常给药组及正常对照组组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。RT-PCR检测VEGFmRNA表达显示,糖尿病模型治疗组对目的基因有表达,表达水平较低,糖尿病模型未治疗组对目的基因有表达,表达水平较高;糖尿病模型治疗组与未治疗组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;正常对照组对目的基因几乎无表达。结论高山红景天组方口服可使糖尿病鼠视网膜VEGF的表达减少,为DR的治疗提供新方法 。     

视网膜酸化诱导VEGF与PEDF表达及其与氧化应激的关系

背景 缺氧与高糖是引起视网膜新生血管生长的主要原因,可引起视网膜糖酵解作用增强,导致组织酸中毒. 目的 探讨视网膜酸中毒对视网膜血管内皮生长因子(VEGF)与色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响及氧化应激的作用.方法 从2周龄雄性SD大鼠中分离出视网膜.分别在NaHCO3调制的pH7.2、6.8、6.5酸性环境的DMEM培养液中培养24 h;另外,在上述酸性培养液中培养后用PBS洗涤视网膜2遍后置于pH值为7.2的新鲜培养液中继续培养24 h;同时,在上述酸性培养液中加入抗氧化剂对视网膜进行培养.制作视网膜标本,然后行苏木精-伊红染色,采用荧光定量聚合酶链反应( PCR)及免疫蛋白印迹技术检测各组大鼠视网膜中VEGF和PEDF蛋白及其mRNA的表达,以pH7.2作为对照. 结果 视网膜培养24 h后,pH7.2组、pH6.8组视网膜层次清晰,但pH6.5组视网膜出现空泡.正常视网膜VEGF mRNA的表达为(112±11)％,pH7.2组为(100±7)％,差异无统计学意义(P=0.55);pH 6.8组、pH 6.5组中的视网膜VEGF mRNA分别为(196±43)％、(251±29)％,均较pH7.2组明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).正常视网膜PEDF mRNA水平为(86±19)％,pH7.2组为(100±.33)％,差异无统计学意义(P=0.64);pH 6.5组视网膜PEDF mRNA水平为(230±66)％,较pH7.2组明显升高(P＜0.05).VEGF与PEDF蛋白与其mRNA表达趋势一致.视网膜酸化纠正后,pH 7.2、6.8、6.5组视网膜VEGF mRNA分别为(100±13)％、(111±9)％、(113±9)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=2.51,P=0.16).PEDF mRNA的表达分别为(100±13)％、(110±9)％、(108±11)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=0.98,P=0.43).加入抗氧化剂后,pH7.2组视网膜VEGF mRNA水平为(100±9)％,pH6.8组为(106±7)％,pH 6.5组为(148±22)％,pH6.5组VEGF mRNA表达水平均明显高于pH 7.2组和pH 6.8组(P＜0.05).pH 7.2、6.8、6.5组大鼠视网膜PEDF mRNA表达分别为(100±31)％、(282±45)％、(480±117)％,差异有统计学意义(F=20.73,P=0.00).结论 视网膜酸化诱导VEGF的表达受到氧化应激的调节,抗氧化剂可促进酸化视网膜PEDF的表达增加,表明氧化应激可抑制PEDF表达.     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质