SOCS3通过抑制STAT3抑制受损伤大鼠初级感觉神经元生长

目的通过慢病毒转导SOCS3和作用相反的突变型SOCS3(mSOCS3),体外研究SOCS3在成年鼠的初级感觉神经元再生中的作用。方法将慢病毒载体质粒pRRL-SOCS3-IRES-GFP,pRRL-mSOCS3-IRES-GFP和pRRL-STAT3ER-IRES-GFP分别转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。完全切断大鼠左侧坐骨神经,术后饲养8-128h,在不同时间点摘取双侧L5背根神经节。通过实时PCR和原位杂交检测DRGs中SOCS3 mRNA的存在;通过背根神经节分离神经元培养,分别将三种慢病毒载体感染神经元细胞,采用免疫荧光染色法观察神经元细胞核质反应和突起的长度。结果大鼠左侧坐骨神经损伤后,SOCS3 mRNA的表达在背根神经节神经元中明显增加,外源性SOCS3能阻止神经元中STAT3的磷酸化及核移位,mSOCS3增强了突起生长。结论 SOCS3可通过抑制STAT3抑制轴突生长。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

PKAc促进成年大鼠背根神经节神经元突起生长及其机制的研究

观察慢病毒载体介导PKA催化亚单位PKAc转染促进成年大鼠原代培养的背根神经节(DRG)神经元突起生长及其机制的研究。我们运用三质粒系统共转染293T细胞合成慢病毒载体LV/PKAc-IRES-GFP和对照病毒LV/GFP,原代分离培养成年大鼠DRG神经元,应用免疫组织化学染色和Western blot等方法检测cAMP/PKA信号通路下游关键转录因子cAMP反应元件连接蛋白(CREB)磷酸化水平,图像分析经组织化学染色后的神经元突起长度和有突起神经元的百分比。结果观察到,慢病毒能介导外源基因在哺乳动物原代培养的神经元中表达,转染LV/PKAc-IRES-GFP的PC12细胞和DRG神经元均能表达外源基因并激活CREB,克服CNS髓鞘蛋白的抑制,促进突起生长。以上实验结果表明拯救成年大鼠神经元cAMP/PKA水平可有效改变神经元内在生长能力,从而改变它们对抑制环境的敏感性,进而促进突起生长。     

细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定*☆

背景：以往关于细胞因子信号转导抑制因子1的研究多用脂质体或其他载体转染的技术,但存在效率低和安全性差等问题。 目的：构建细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体并进行鉴定。 方法：实验设计3组针对细胞因子信号转导抑制因子1的短发夹RNA序列,应用基因重组技术插入pPll3.7载体,测序正确的重组病毒质粒与包装质粒通过共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,感染A549细胞,western blot检测目的蛋白细胞因子信号转导抑制因子1在靶细胞中的表达。 结果与结论：实验通过对重组载体进行测序分析证实短发夹RNA插入慢病毒载体,慢病毒载体上清成功转染A549细胞后western blot检测结果显示该载体抑制了细胞因子信号转导抑制因子1蛋白在A549细胞有表达。说明实验成功构建了细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体。 关键词：细胞因子信号转导抑制因子1;慢病毒载体;RNA干扰;A549细胞;组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.030     

CRMP4慢病毒载体的构建及其对神经元突起生长的影响

目的 探讨CRMP4对海马神经元突起生长的影响。 方法 利用PCR技术扩增CRMP4目的基因片段,与病毒载体连接,经过PCR、酶切和鉴定后与包装质粒共转293T细胞,制备慢病毒载体,之后感染海马神经元,观察神经元突起生长的变化,并进行定量分析。 结果 扩增出CRMP4目的基因,成功构建CRMP4慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107~1.0×108 U/ml;对照细胞转染空质粒后见GFP表达,分布于神经元的胞体和突起,细胞随着发育不断极化,分化出树突和轴突,突起不断延长;过表达CRMP4后,可见神经元的突起延长,分支较对照组增多;定量结果显示,神经元突起总长度包括树突和轴突均较对照组增多,分支数目亦较对照组增多,差异显著（P<0.05）。 结论 成功构建了携带大鼠CRMP4基因的慢病毒表达载体;过表达CRMP4基因可以促进神经元突起的生长。     

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的：通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。 方法： 根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链，插入到pENTR/U6质粒缺口末端，连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体；通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest 载体上,构建含U6启动子、靶序列和Pol Ⅲ终止子表达框的MTCOX-I shRNA表达重组体；经脂质体导入293FT细胞，包装成慢病毒，收集病毒上清并检测其滴度。Western blotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结果： 将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。Western blotting检测结果证实构建的MTCOX-I shRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结论： 成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C3 过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3 基因片段;用AgeI 酶切线性化GV365 慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3 载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T 细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot 检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA 法测定慢病毒载体滴度。结果:获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3 慢病毒载体,通过PCR 及DNA 测序鉴定,证明GV365-SEC3 质粒构建正确;转染293T 细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 kD 大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA 检测病毒载体滴度为5 108 TU/ ml。结论:成功构建GV365鄄SEC3 过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。     

携eGFP及表达人gp100-TCR基因的慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携eGFP的人gp100-TCR基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,从pGCsamgp100APB质粒上扩增出人gp100-TCR片段,将其插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达载体中,同时将其U6启动子替换为EF-1a启动子,形成慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a。将其与包装质粒混合,采用磷酸钙转染法转染293FT细胞,包装产生慢病毒,荧光显微镜观察GFP蛋白的表达水平。检测病毒滴度。结果 PCR、酶切及测序表明慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a构建成功。转染后的293FT细胞在荧光显微镜观察可见强绿色荧光,形成的慢病毒可感染293FT细胞,包装的慢病毒浓缩后滴度为4.5×106 TU/ml。结论成功构建eGFP和gp100-TCR共同表达的慢病毒表达载体,为gp100-TCR在肿瘤治疗中的功能研究提供了有效平台。     

Nerve growth factor expression by PLG-mediated lipofection

Biomaterials capable of efficient gene delivery provide a fundamental tool for basic and applied research models, such as promoting neural regeneration. We developed a system for the encapsulation and sustained release of plasmid DNA complexed with a cationic lipid and investigated their efficacy using in vitro models of neurite outgrowth. Sustained lipoplex release was obtained for up to 50 days, with rates controlled by the fabrication conditions. Released lipoplexes retained their activity, transfecting 48.2+/-8.3% of NIH3T3 cells with luciferase activity of 3.97x10(7)RLU/mg. Expression of nerve growth factor (NGF) was employed in two models of neurite outgrowth: PC12 and primary dorsal root ganglia (DRG) co-culture. Polymer-mediated lipofection of PC12 produced bioactive NGF, eliciting robust neurite outgrowth. An EGFP/NGF dual-expression vector identified transfected cells (GFP-positive) while neurite outgrowth verified NGF secretion. A co-culture model examined the ability of NGF secretion by an accessory cell population to stimulate DRG neurite outgrowth. Polymer-mediated transfection of HEK293T with an NGF-encoding plasmid induced outgrowth by DRG neurons. This system could be fabricated as implants or nerve guidance conduits to support cellular and tissue regeneration. Combining this physical support with the ability to locally express neurotrophic factors will potentiate regeneration in nerve injury and disease models.     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选

目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体。并检测其在大鼠神经元中的作用。方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率。在最佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的最有效的干扰序列与抑制效率。结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率最高(93%),并保持神经细胞良好的生存状态。转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74%±1.40%,81.19%±1.36%,94.10%±2.41%。结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为10⁶ TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.