极小胚胎样干细胞的研究现状和眼科临床意义

极小胚胎样干细胞（ very small em yonic-like stem cells, VSELs）是美国路易斯维尔大学Kucia 研究小组从小鼠骨髓和人脐带血中分离出一种具有类似胚胎干细胞生物特性的多潜能成体干细胞。与胚胎干细胞相似的外表---细胞形态及表面标志、以及相似的内在---多分化潜能决定了VSELs一出现就被细胞替代疗法视为最有潜力的种子细胞,本文就VSELs的研究历程及在眼科干细胞治疗视网膜退行性疾病中的临床意义作一综述。     

胚胎干细胞体外培养及在眼科的研究进展

胚胎干细胞（ESC）具有体外无限增生和自我更新并能够分化为体内各种细胞的潜能。ESC独特的生物学特性被广泛应用于生物和医学研究领域,因此,成功地培养ESCs对于更深入地探讨ESCs的作用机制是非常有帮助的。目前,培养和分化的ESCs已用于一些眼科疾病的治疗,如视网膜变性性疾病和严重的角膜疾病等。ESC在动物和人的胚胎发育、致畸实验、组织工程和移植治疗等研究领域具有重要的科学意义和巨大的应用前景。对胚胎干细胞的发展、体外培养体系及在眼科研究进展进行综述。     

胚胎干细胞向角膜上皮细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞（ESCs）是一种具有多向分化潜能的细胞,在一定条件诱导下能分化为骨细胞、软骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞,在眼表的修复和重建方面具有广阔的应用前景.目前,大量研究已证实,ESCs可以被定向诱导分化为角膜上皮样细胞,并且对眼表损伤的修复也有重要作用.ESCs作为组织工程角膜的种子细胞仍存在一些问题需要解决,如定向分化机制不明确、细胞大量扩增可能存在致瘤问题等.就ESCs向角膜上皮细胞分化的研究进展进行综述.     

干细胞移植在眼科的应用前景

干细胞具有自我更新、高度增殖及多向分化潜能的优点，主要分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞移植在眼科的应用尚处于实验研究阶段，其在视网膜变性疾病及视神经病变治疗中的应用潜能渐成为研究的热点。越来越多的动物实验表明成体干细胞具有横向分化潜能，其自身的应用优势为难治性眼科疾病的治疗提供了新的途径。本就干细胞移植在眼科应用的前景作一综述。     

诱导多能干细胞在眼科疾病的研究进展

可诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由体细胞或成体细胞重编程转化而来,这项技术引起了学术界空前的关注,越来越多的相关研究随之开展。它是通过人工方法将适当的外源性转录因子导入体细胞或成体干细胞,使之转化为具有无限增殖潜能和定向分化能力、类似于胚胎干细胞的一类干细胞。在不断探索发展多能干细胞培养转化技术的过程中,已经取得不少突破性的进展,这为将来细胞移植成为临床治疗方法奠定了基础。同时各种研究成功诱导出类似人体细胞的干细胞,并在动物实验中得到乐观的结果。我们主要探讨iPSC在眼科疾病方面的研究进展。     

骨髓间充质干细胞在眼科应用的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓组织中造血干细胞以外的一类成体干细胞,具有很强的自我更新能力、多向分化潜能及低免疫原性,可在特定的条件下诱导分化为不同的细胞,研究较为成熟的有成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等,在组织工程学及细胞替代移植疗法中有广阔的应用前景.近年来,BMSCs因其自身的应用优势而成为眼科研究的热点.就BMSCs在眼科的应用研究进行综述.     

诱导多能干细胞在眼科的研究进展

以视网膜神经元不可逆性损伤为病理基础的视网膜变性类疾病是目前主要的致盲性眼病之一,针对其神经损伤修复的药物治疗却十分有限.最新研究发现的诱导多能干细胞(iPSCs)是通过基因转染技术将转录因子导入动物或人的体细胞内,使体细胞直接重构成为胚胎干细胞样的多潜能细胞.由患者体细胞诱导的iPSCs不仅具有强大的自我更新和分化潜能,而且可避免以往胚胎干细胞存在的宿主排斥反应和伦理学限制等缺点,同时眼部屈光介质清晰的特点还使得自体干细胞移植治疗视网膜变性类疾病具有易于观察、便于操作的优势,相信会为这一难治性疾病的治疗开辟新的途径.对iPSCs的研究发展历程、iPSCs的特性和优势、iPSCs在眼科的诱导和定向分化能力进行综述.     

胚胎干细胞在裸鼠眼内向神经元和视网膜样结构分化

目的 研究小鼠胚胎干细胞在裸鼠眼内的生长特性。 方法 将未分化的胚胎干细胞移植到Balb/c裸小鼠眼内。14～20 d处死裸鼠,观察其形态学和免疫组织化学变化。 结果 胚胎干细胞移植到裸鼠眼内,在眼前房和玻璃体腔内能见到黄白色物,逐渐增大。光镜检查：在前房和玻璃体腔内均能见到未分化细胞和已分化的细胞,部分细胞的形态和排列方式与视网膜组织中的一些结构相似,其免疫组织化学抗神经元特异性烯醇化酶染色大部分已分化细胞呈强阳性反应。 结论 胚胎干细胞在裸小鼠眼内的特定环境中,向神经元和视网膜样结构分化。（中华眼底病杂志,2000,16：213-284）     

胚胎干细胞视网膜下移植实验研究初步报告

目的 探讨胚胎干细胞(embronic stem　cell,ESC)在视网膜下间隙分化发育的情况。 方法 ESC经体外悬浮培养4 d形成胚胎体(embryonic body,EB)备作移植。将ESC以及EB联合或不联合视黄酸(retinoic acid,RA)分别移植到SD大鼠玻璃体腔或视网膜下,在视网膜下间隙移植眼,于移植前结扎眼动脉40 s造成缺血再灌注损伤的实验模型。于移植后14～28 d摘除眼球,观察移植物分化发育的情况。 结果 ESC在SD大鼠玻璃体腔内迅速增生,形成非典型性增生团块;EB在缺血再灌注损伤眼视网膜下间隙经RA诱导能定向分化为视网膜感光细胞;而在无RA作用下向多极化分化发育。单独RA视网膜下间隙注射后导致神经视网膜上皮增生变厚。 结论 ESC源性的EB在缺血再灌注眼视网膜下间隙经RA诱导能向视网膜感光细胞分化。（中华眼底病杂志,2000,16：213-284）     

胚胎干细胞诱导分化及眼内移植的研究进展

视网膜色素变性及老年性黄斑变性是严重威胁视力的疾病,目前临床上缺乏有效的治疗方法.胚胎干细胞具有无限增生、多向分化的潜力,能定向分化为视网膜前体细胞以及各种神经细胞.胚胎干细胞源性神经细胞的眼内移植为此类痰病的治疗带来了希望,成为近年来该领域的研究热点.本文对近年来不同培养条件对胚胎干细胞定向诱导分化的影响、供体视网膜前体细胞与受体视网膜组织作用的可能机制以及视网膜前体细胞眼内移植的进展进行综述.     

Development of gene and stem cell therapy for ocular neurodegeneration

Retinal degenerative diseases pose a serious threat to eye health, but there is currently no effective treatment available. Recent years have witnessed rapid development of several cutting-edge technologies, such as gene therapy, stem cell therapy, and tissue engineering. Due to the special features of ocular structure, some of these technologies have been translated into ophthalmological clinic practice with fruitful achievements, setting a good example for other fields. This paper reviews the development of the gene and stem cell therapies in ophthalmology.     

常见眼部疾病干细胞治疗进展

干细胞移植技术作为一种新的疾病治疗手段,近年来受到越来越多关注。在眼科领域,干细胞移植技术同样得到了一定的研究和应用。在治疗眼部疾病,尤其是治疗与血管和神经退化相关的疾病方面,干细胞移植治疗技术发挥着积极的作用。本文对常见眼部疾病干细胞移植治疗的研究进展作一综述。     

胚胎千细胞诱导分化为视网膜祖细胞的体外研究

目的 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)诱导为视网膜祖细(retinal progenitor cells,RPC)的体外培养方法,为致盲性视网膜变性疾病的治疗提供种子细胞.方法 用细胞免疫荧光染色法和流式细胞术对mESC进行mESC标记物阶段特异性胚胎抗原1、细胞增殖核抗原Ki67、细胞周期和碱性磷酸酶进行鉴定后,在无血清条件下悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB)并添加抑制因子1、左右决定因子A和γ-促分泌酶抑制剂等诱导分化为RPC,并对其分化的细胞进行标记物兔来源配对盒基因6(paired box6,Pax6)、兔来源性别决定区Y框蛋白(Sox2)和鼠来源转录因子同源异型框蛋白(orthodentical homeobox2,Otx2)的检测以及增殖能力和细胞周期的检测.结果 mESC标记物碱性磷酸酶阳性表达,特异性胚胎抗原1阳性率为(80.66±0.64)％,Ki67和细胞周期检测显示有较高增殖能力.定向诱导分化后,RPC标记物Pax6、Sox2和Otx2阳性率分别为(50.87±2.97)％、(49.10±2.60)％和(32.01±3.87)％,Ki67和细胞周期检测均显示诱导后的RPC具有一定的增殖能力.结论 在特定的细胞因子作用下,mESC可以诱导分化为RPC.     

羊膜和角膜干细胞移植治疗眼表疾病临床观察

目的探讨羊膜移植、自体角膜干细胞移植及自体体外培养角膜干细胞移植重建眼表治疗眼表疾病的疗效。方法眼表疾病43例46眼（瘢痕性结膜囊狭窄、睑球粘连6例6眼，角结膜化学、热烧伤10例13眼，原发和复发性翼状胬肉切除术后结膜缺损27例27眼）进行羊膜移植、自体角膜干细胞移植及自体体外培养角膜干细胞移植，观察植片及角结膜上皮愈合、组织浸润和新生血管情况。结果羊膜移植术重建结膜囊效果满意，睑球粘连松解。羊膜、自体体外培养角膜干细胞移植术治疗角结膜烧伤均可使眼表上皮化，基质炎性浸润减轻，新生血管明显减少；自体体外培养角膜干细胞移植对角膜缘干细胞损伤严重的患者效果显著。自体和自体体外培养角膜干细胞移植治疗翼状胬肉均有良好效果，术后不适症状轻时间短，角膜创面愈合快，随访（1～2）y两种术式各复发1眼。自体体外培养角膜干细胞移植对复发性翼状胬肉切除术后较大的结膜缺损更为适合。结论羊膜移植、自体角膜干细胞移植和自体体外培养角膜干细胞移植对重建眼表都有重要的功效，手术方式的选择必须根据角膜干细胞损伤的程度、范围进行选择。     

Transforming ocular surface stem cell research into successful clinical practice

It has only been a quarter of a century since the discovery of adult stem cells at the human corneo-scleral limbus. These limbal stem cells are responsible for generating a constant and unending supply of corneal epithelial cells throughout life, thus maintaining a stable and uniformly refractive corneal surface. Establishing this hitherto unknown association between ocular surface disease and limbal dysfunction helped usher in therapeutic approaches that successfully addressed blinding conditions such as ocular burns, which were previously considered incurable. Subsequent advances in ocular surface biology through basic science research have translated into innovations that have made the surgical technique of limbal stem cell transplantation simpler and more predictable. This review recapitulates the basic biology of the limbus and the rationale and principles of limbal stem cell transplantation in ocular surface disease. An evidence-based algorithm is presented, which is tailored to clinical considerations such as laterality of affliction, severity of limbal damage and concurrent need for other procedures. Additionally, novel findings in the form of factors influencing the survival and function of limbal stem cells after transplantation and the possibility of substituting limbal cells with epithelial stem cells of other lineages is also discussed. Finally this review focuses on the future directions in which both basic science and clinical research in this field is headed.     

Corneal forward shift after excimer laser keratorefractive surgery

The excimer laser keratorefractive surgery inevitably compromises structural integrity of the cornea by the surgical tissue subtraction and loss of integrity of Bowman’s membrane. Forward shift of the cornea is commonly seen after both photorefractive keratectomy (PRK) and laser in situ keratomileusis (LASIK). Antero-posterior movement of the cornea is evaluated by measuring the posterior corneal elevation with the scanning-slit corneal topography (Orbscan). Eyes with thinner cornea, higher intraocular pressure, and higher myopia requiring greater laser ablation were more predisposed to forward shift of the cornea. After PRK, there was a trend toward progressive forward shift of the cornea, but the progression stabilized 6 months after surgery. Because progressive thinning and expansion of the cornea were not observed during the one-year observation period after PRK, the forward shift of the cornea does not represent true ectasia. Forward shift of both corneal surfaces would add to the tendency toward myopic regression after excimer laser surgery.     

小鼠胚胎干细胞条件培养基体外促进人角膜内皮细胞增殖的研究

目的　观察小鼠胚胎干细胞条件培养基（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ,ＥＳＣ-ＣＭ）是否可以在体外促进人角膜内皮细胞（ｈｕｍａｎｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＣＥＣｓ）的增殖。方法　利用角膜内皮后弹力层组织块方法进行原代培养Ｐ０ＨＣＥＣｓ。实验组使用含有２５％ＥＳＣ-ＣＭ的培养液进行培养,对照组使用普通角膜内皮细胞培养液（ｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｍｅｄｉ-ｕｍ,ＣＥＭ）进行培养。倒置相差显微镜、反转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ-ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ-ＰＣＲ）鉴定ＨＣＥＣｓ;倒置相差显微镜观察细胞的形态及萌出时间;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、免疫组织化学法观察ＨＣＥＣｓ的泵相关功能蛋白（ｚｏｎａｏｃｃｌｕ-ｄｅｎｓｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＺＯ-１）及Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶的表达。Ｇｉｅｍｓａ染色细胞克隆实验、免疫组织化学及流式细胞学检测Ｋｉ６７阳性率的方法比较ＨＣＥＣｓ的增殖能力;流式细胞学方法检查细胞周期及细胞凋亡情况。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和免疫组织化学方法检测细胞周期负性调节蛋白Ｐ２１的水平,初步探讨其可能的作用机制。结果　原代培养时,２５％ＥＳＣ-ＣＭ组培养的ＨＣＥＣｓＰ２细胞爬出,细胞形态呈典型多角形结构。ＣＥＭ在Ｐ２时细胞形态变大,失去了多角形结构。２５％ＥＳＣ-ＣＭ 组和ＣＥＭ组均表达ＺＯ-１、Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的Ｋｉ６７阳性率、克隆形成数量、进入到细胞周期Ｓ期和Ｇ２期的比例均高于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的细胞凋亡数量和Ｐ２１阳性率均低于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。结论　２５％ＥＳＣ-ＣＭ组可显著促进ＨＣＥＣｓ增殖;其作用可能是通过抑制Ｐ２１蛋白的表达和抑制细胞凋亡实现的,为ＨＣＥＣｓ体外大量扩增提供了一种新方法。     

干细胞治疗视网膜疾病的研究进展

目的 视网膜是视觉中光电感应的部位，其功能与解剖结构关系密切。外界光刺激、机械损伤或其他疾病的并发症均可导致光感受器的病理变化，进一步引起视网膜色素变性、视网膜脱离及其他致盲性疾病。对于这类疾病，国内外学者进行了大量的研究，随着干细胞研究的推广，越来越多的研究人员认识到干细胞作为细胞供体进行视网膜疾病治疗的潜能。本文对其中的一些工作进行简要综述。     

Tissue engineered corneal epithelium derived from clinical-grade human embryonic stem cells

PurposeTo construct tissue engineered corneal epithelium from a clinical-grade human embryonic stem cells (hESCs) and investigate the dynamic gene profile and phenotypic transition in the process of differentiation.MethodsA stepwise protocol was applied to induce differentiation of clinical-grade hESCs Q-CTS-hESC-1 and construct tissue engineered corneal epithelium. Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis was performed to monitor gene expression and phenotypic changes at different differentiation stages. Immunostaining, real-time quantitative PCR and Western blot analysis were conducted to detect gene and protein expressions. After subcutaneous transplantation into nude mice to test the biosafety, the epithelial construct was transplanted in a rabbit corneal limbal stem cell deficiency (LSCD) model and followed up for eight weeks.ResultsThe hESCs were successfully induced into epithelial cells. scRNA-seq analysis revealed upregulation of ocular surface epithelial cell lineage related genes such as TP63, Pax6, KRT14, and activation of Wnt, Notch, Hippo, and Hedgehog signaling pathways during the differentiation process. Tissue engineered epithelial cell sheet derived from hESCs showed stratified structure and normal corneal epithelial phenotype with presence of clonogenic progenitor cells. Eight weeks after grafting the cell sheet onto the ocular surface of LSCD rabbit model, a full-thickness continuous corneal epithelium developed to fully cover the damaged areas with normal limbal and corneal epithelial phenotype.ConclusionThe tissue engineered corneal epithelium generated from a clinical-grade hESCs may be feasible in the treatment of limbal stem cell deficiency.     

干细胞移植治疗视网膜疾病的研究现状

许多视网膜疾病可造成视网膜光感受器的损伤,导致不可逆的视力丧失,目前尚无有效的临床治疗手段。干细胞移植治疗此类视网膜疾病是目前研究热点,并且被认为是最有前景的治疗方法之一,本文就干细胞移植治疗视网膜疾病的研究现状作一综述。