骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化的影响因素

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有干细胞的一般特性,主要存在于骨髓基质中,具有横向分化潜能,可以向3个胚层细胞进行分化。近年来,许多学者通过实验研究BMSCs在体外诱导分化为神经样细胞的机制。体外培养、扩增BMSCs分别采用化学诱导剂或生物诱导剂可诱导BMSCs分化神经样细胞,并表达神经元标志物。本文就对BMSCs向神经样细胞诱导分化的影响因素予以综述。     

DMSO 联合神经营养因子BDNF 诱导BMSCs 向神经样细胞分化

目的：探讨脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）联合二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向神经样细胞分化的效果,初步检测miRNA-26a 在神经细胞分化过程中的表达量变化。方法：从大鼠股骨抽取骨髓分离BMSCs,DMSO 对其预诱导,随后用含BDNF 的神经细胞培养基培养BMSCs,诱导其分化为神经细胞。免疫组化鉴定分化神经元样细胞特异标记物：神经元特异烯醇酶（neuron specifi c enolase,NSE）。实时定量PCR 法检测神经分化前后酪氨酸磷酸酶蛋白（tyrosine phosphatase protein,PTEN）基因/mTOR 和miRNA-26a 的表达变化。结果：100 ng·mL-1 BDNF 联合3% DMSO 可诱导BMSCs 向神经元样细胞分化,分化后神经细胞标志物NSE 蛋白表达呈阳性,且神经分化过程中miRNA-26a PTEN/mTOR 的含量明显上调。结论：3%DMSO 和 100 ng·mL-1 BDNF 的混合诱导剂可诱导大鼠BMSCs 向神经元样细胞分化,而miRNA-26a 可能通过PTEN/mTOR 调节神经分化。     

大鼠大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的建立大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的方法。方法原代培养并鉴定骨髓间充质干细胞;用条件培养基、无血清培养基、DMEM分别诱导骨髓间充质干细胞6h和24h;用免疫荧光染色的方法鉴定由骨髓间充质干细胞分化而来的神经样细胞。结果骨髓间充质干细胞表达CD106、CD90、CD29和CD44标记物,不表达CD71、CD45和CD34,回收得到的条件培养基可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,这些神经样细胞的免疫荧光染色呈β微管蛋白Ⅲ、胶质原纤维酸性蛋白、巢蛋白阳性,且阳性比例明显高于实验对照组,差异有高度统计学意义（P〈0.001）。结论大脑皮层细胞条件培养液能促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化。     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的电生理特性

目的：利用乳鼠视网膜细胞条件分化液将骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为视网膜神经节样细胞,比较BMSCs、诱导后的视网膜神经节样细胞以及原代培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的电生理特性。方法：取传至第3代的大鼠BMSCs,利用乳鼠视网膜细胞条件分化液作为诱导剂,进行增殖培养、分化诱导;免疫组织化学法观察NF、MA...     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞向干细胞因子的趋化性迁移

目的研究成神经细胞分化不同阶段的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向干细胞因子（SCF）的趋化性迁移。方法 Percoll密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,体外传代并扩增纯化,通过免疫荧光染色及多向分化对其进行鉴定。采用碱性成纤维生长因子（bFGF）、丁羟基茴香醚（BHA）联合诱导剂对BMSCs进行成神经细胞诱导,观察分化各时期的细胞形态变化。利用Dunn chamber研究SCF对不同分化阶段BMSCs趋化性迁移的影响。结果 Dunn chamber迁移实验显示,SCF诱导实验组细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组（P〈0.05）,表明SCF对BMSCs具有趋化作用。此外,分化不同状态的BMSCs向SCF的趋化迁移程度也不同。结论 BMSCs可以分化为神经样细胞,其对SCF的趋化性迁移与分化状态密切相关。     

骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

目的：建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法.方法：体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10 μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmoVLBHA、2％ DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli＇s四血管复制的血管性痴呆（VaD）模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Moms水迷宫检测大鼠学习记忆能力.结果：大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90％以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义（P ＜0.05）;BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞.结论：体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源.     

人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化

目的对人骨髓间充质干细胞进行原代提取、细胞性质鉴定及成神经细胞分化诱导,探讨人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能性,为自体细胞移植提供种子。方法使用试剂盒进行骨髓有核细胞混悬液的制备,纯化培养后对细胞进行流式细胞术鉴定,对成神经分化诱后细胞进行染色形态学观察。结果原代提取细胞培养至10天时可呈漩涡性生长,类细胞克隆样。细胞存在稳定的干性表达,70%骨髓间充质干细胞可实现成神经细胞诱导分化。结论原代人骨髓间充质干细胞可实现向成神经细胞的诱导分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨大鼠骨髓间充质干细胞 ( rat mesenchymal stem cells,r MSCs)体外诱导分化成神经元的能力。方法 :用 0 .2 5、0 .5、1 .0 mmol· L-1IBMX诱导传代的 r MSCs,待细胞分化后进行形态学观察 ,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。结果 :0 .5 mmol· L-1IBMX诱导细胞效果最好 ,2 d即可见有神经元样细胞出现 ,6d神经元样细胞占细胞总数的 ( 2 3.2± 2 .3) %,NSE染色阳性。未分化细胞表达 nestin,诱导 3d,阳性细胞增多 ,6d减少。结论 :体外 r MSC能扩增、传代 ,并被诱导分化成神经元样细胞     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）在体外条件下对骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经千细胞（NSCs）和神经样细胞分化的诱导作用。方法 采用出生4周左右大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为两组：实验组细胞加入bFGF和EGF,进行诱导分化;对照组不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察,记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单抗鉴定。结果 实验组诱导7d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,均有Nestin、NSE、GFAP阳性细胞表达,且3种细胞数量差别有显著性（t=3．266～6．099,P〈0．05）。而对照组细胞仍为典型的成纤维细胞形态,无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。结论 bFGF、EGF可以诱导BMSCs向NSCs分化,并可调控神经元分化,促进神经元细胞成熟。     

CM-Dil体外标记骨髓间充质干细胞及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪

目的：探讨氯甲基苯甲酰胺（CM-Dil）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外标记及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪能力。方法：采用贴壁培养法分离、纯化、扩增BMSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子（EGF）和维甲酸（RA）诱导BMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测神经元表面标志神经细胞特异性标志微管相关蛋白-2（MAP-2）和神经元特异核蛋白（NeuN）的表达。4、6和8 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs,CCK-8法检测不同浓度CM-Dil对细胞的毒性作用,流式细胞仪检测其标记率。选用成年雄性Wistar大鼠,制备烧伤大鼠模型,经球后静脉注射1×107个CM-Dil标记的BMSCs。大鼠烧伤2周及6个月后取肠组织,制备冰冻切片,用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在大鼠肠组织内的定植情况。结果：免疫细胞化学结果表明,BMSCs 诱导分化的神经元样细胞表达NeuN和MAP-2。CCK-8法结果表明,8 mg•L ^-1 CM-Dil组细胞毒性显著高于对照组（P<0.05）,4和6 mg•L^-1 CM-Dil与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs对细胞无毒性,标记率达93.9%,细胞形态无改变。冰冻切片激光共聚焦显微镜观察,CM-Dil标记的BMSCs在大鼠烧伤后2周及6个月的肠组织内定植。结论：CM-Dil可以体外标记BMSCs,可以用于BMSCs在烧伤大鼠模型肠组织组织内的示踪研究。     

体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探索体外诱导胎盘间充质干细胞(PMSCs)分化为神经元样细胞的方法。方法:消化胎盘组织,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含叔丁对甲氧酚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)及碱性成纤维细胞因子(b-FGF)的条件培养基培养细胞,诱导分化为神经元样细胞,采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果:胎盘组织的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有相似形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性的烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。     

小鼠中脑神经干细胞体外培养方法的研究

目的改进小鼠中脑神经干细胞(NSCs)分离培养方法。方法分别采用机械法和酶消化法分离出生1～3d的小鼠中脑组织,在含体积分数为2%B27及20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养。采用巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色方法鉴定NSCs和分化细胞。结果在含bFGF及B27的DMEM/F12培养基中,可形成悬浮生长Nestin呈阳性的神经球。诱导分化的细胞可见GFAP或NSE免疫反应阳性细胞。机械法较酶消化法可获得较多的NSCs。结论在DMEM/F12培养基中添加2%B27及20ng/mL的bFGF可成功获得中脑NSCs,机械法为一种简便而有效的NSCs分离方法。     

不同方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的观察两种方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向神经样细胞分化的效果。方法自大鼠股骨中提取骨髓细胞,利用Percoll法进行BMSC分离、纯化及鉴定。取第5代细胞,应用两种方法进行诱导。方法一（BHA组）：200μmol/L丁羟基茴香醚（BHA）、10 ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）和2%二甲基亚砜（DMSO）联合诱导细胞;方法二（RA组）：全反式维甲酸（RA）和β-巯基乙醇（β-ME）联合诱导细胞。同时设正常培养的BMSC为对照组。实验过程中对细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。结果BHA组诱导5 h,细胞即发生明显的形态改变,出现胞体回缩、突触伸展等神经干细胞的形态特征,而RA组诱导1周未出现神经干细胞形态。免疫荧光染色显示两种方法诱导的细胞均能表达神经前体细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达星形胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。BHA组与RA组表达NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对照组不表达NSE,诱导组与对照组比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为表达神经细胞标志物的神经样细胞。     

大鼠神经干细胞的培养和鉴定

目的：自新生第1天（P1期）和成年SD大鼠海马和纹状体分离培养神经干细胞。方法：分别分离P1期和成年SD大鼠海马和纹状体组织，制成单细胞悬液，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、表皮生长因子（EGF）和B27的DMEM／F12培养液中进行培养，形成神经球（neurosphere)后每8－10d传代1次，以免疫组织化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及原代和传代培养的神经球分化后的细胞进行鉴定。结果：在上述条件下培养及传代的细菌不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白（nestin)阳性的神经球；神经球贴壁后分化的细胞表现为神经元和星形胶质细胞的形态，且分别呈神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性。结论：新生及成年SD大鼠的海马和纹状体存在神经干细胞。