结核分枝杆菌Ag85 DNA疫苗研究进展

结核病（tuberculosis，TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis，MTB）引起的人兽共患的慢性传染病，可累及全身多个脏器，但以肺结核（pulmonary tuberculosis；PTB）最为常见。由于MTB耐药株出现、艾滋病合并MTB感染以及大规模高危人群流动，因而造成TB的全球流行。据世界卫生组织估计，2000年全球TB感染人数20亿，发病人数1000万，死亡人数350万；2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查发现我国TB感染人数5．5亿．活动性结核人数600万，死亡人数25万，TB已成为我国乃至世界危害最严重的疾病之一。     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达

目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85B DNA疫苗的免疫原性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,并利用293T细胞对其表达进行检测.方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal ribo some entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48 h后提取细胞总蛋白,表达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析.结果 限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85AIRES-Ag85B基因序列和阅读框架正确.将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测证实两种抗原可在同一载体中各自独立表达.结论 成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基因的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础.     

结核分枝杆菌Ag85复合物相关疫苗研究进展

目前全球TB疫情呈上升趋势,而惟一使用的结核病疫苗--BCG的保护效力大不如前,因此新型结核病疫苗的开发迫在眉睫。利用Ag85复合物在Mtb感染中具有明显保护性效应为基础而研制的疫苗受到广泛关注。笔者对Ag85复合物相关亚单位疫苗、重组BCG和基因疫苗研究取得的成果进行综述,结果表明少数Ag85复合物相关疫苗的保护作用超过BCG,某些新疫苗作为初种疫苗给予新生儿、儿童和青少年接种是安全、有效的;作为增强剂给予成人接种,可以提高机体免疫力;某些疫苗与化疗药物联合可以提高机体的免疫力,提高化疗效果,但能否取代BCG尚需大规模临床实验证实。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

Ag85b-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ag85b-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性和治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85b的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。结果通过PCR扩增获得Ag85b基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明成功地构建了Ag85b基因pYU295重组质粒。将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好。pYUB295-Ag85b重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明：Ag85b-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85b蛋白在卡介苗中分泌表达。结论成功构建了Ag85b-卡介苗重组疫苗。     

结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的比较结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应,为研制高效结核杆菌基因疫苗奠定基础。方法将雌性C57BL/6健康小鼠54只,随机分为3组,即结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗(pIRES-Ag85B/GM-CSF)组、结核杆菌Ag85B基因疫苗(pIRES-Ag85B)组和空载体(pIRES)组,分别小鼠肌内注射疫苗,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标,同时另取C57BL/6小鼠,随机分成4组,第1、2、3组免疫方法与上述各组免疫方法相对应,第4组每只小鼠背部皮下注射1×106CFU卡介苗(BCG),作为阳性对照,进行动物免疫保护性实验,比较分析两种基因疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫原性和免疫保护性明显强于结核杆菌Ag85B基因疫苗。结论结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗能增强结核病基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。     

Ag85A抗体IgG表型在结核性胸膜炎诊断中的应用

目的探讨Ag85A抗体IgG在结核性胸膜炎患者外周血清及胸腔积液中的表达水平并探索其对临床诊断与预后判断的指导意义。方法收集53例结核性胸膜炎患者,38例恶性肿瘤胸膜转移患者和28例良性胸水患者的外周血及胸腔积液,并收集12例正常人的外周血,ELISA法检测血清和胸腔积液中Ag85A抗体IgG的表达,并对胸腔积液进行总蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)检查。结果与肿瘤胸膜转移患者、良性胸水患者和正常人相比,结核性胸膜炎患者外周血及胸腔积液中Ag85A抗体IgG水平明显升高(P<0.01);而肿瘤胸膜转移患者、良性胸水患者和正常人体液中的Ag85A抗体IgG水平无明显差异(P>0.05)。胸腔积液中Ag85A抗体IgG吸光度为1.435,可作为诊断结核性胸膜炎的cut-off值,其敏感性和特异性分别为79.2%和87.2%。结核性胸膜炎患者胸腔积液中Ag85A抗体IgG水平与胸腔积液中总蛋白质和LDH含量呈正相关。结论胸腔积液中Ag85A抗体IgG水平可作为结核性胸膜炎诊断和预后判断的生物学标志物。     

携带结核杆菌Ag85B靶细胞的构建、鉴定及应用

目的构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的靶细胞以便评定结核疫苗的特异性细胞毒(CTL)作用。方法将携带有Ag85B基因的重组质粒pTB30s转入小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫组化染色法鉴定阳性克隆细胞胞内的Ag85B基因转录和蛋白表达水平;同时,用接种过BCG,pTB30s或生理盐水(NS)小鼠脾脏单个核细胞作为效应细胞,G418高压筛选的阳性克隆细胞为靶细胞,用MTT法检测各组CTL杀伤活性。结果RT-PCR以及免疫组化结果显示,阳性细胞能稳定表达Ag85B。CTL杀伤实验:BCG、pTB30s及NS对照组杀伤率分别为28.14%、45.18%和5.13%。结论含有Ag85B靶细胞构建成功及应用,为研究结核疫苗的免疫效果提供了较好的研究手段。     

Ag85B DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

由于卡介苗(BCG)的免疫效果不稳定，结核分枝杆菌(MTb)耐多药菌株的流行以及MTb与艾滋病毒联合感染病例的不断增加，结核病与艾滋病、疟疾一起被世界卫生组织(WHO)列为严重威胁人类健康的主要传染病之一，寻找一种比BCG更有效的抗MTb感染的疫苗已经成为当务之急。DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一种崭新的免疫接种技术，能在宿主体内表达病原体抗原，通过内源性抗原肽提呈方式有效地诱导全面的免疫应答，尤其是特异性CTL的形成。MTb Ag85B是被证实具有较强免疫保护作用的蛋白成分。本研究在已经构建Ag85B真核表达质粒并证实能在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫应答的基础上，进一步研究其在小鼠体内抗MTb感染的能力。     

结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

结核杆菌Ag85B蛋白的表达及免疫特性的试验研究

正Ag85B是结核分枝杆菌最主要的分泌蛋白,参与结核分枝杆菌细胞壁的合成,能与人纤维连蛋白结合,参与结核病的形成,且在T细胞上有多个表位能诱导机体产生保护性免疫应答。因此,本研究对结核杆菌Ag85B蛋白的细胞免疫特性、体液免疫特性以及免疫应答进行研究,以找到诊断和控制结核病的有效方法。1资料与方法1.1实验材料大肠杆菌DH5α和BL21、p ET-30a载体、BCG丹麦株、结核分枝杆菌H37Rv、李斯特重组     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒     

卡介苗分泌型Ag85A基因fbpA转化番茄的检测与鉴定

目的了解卡介苗分泌型Ag85A基因fbpA在番茄中转化的情况。方法采用叶片煮沸快速PCR法检测fbpA基因；以番茄总DNA为模板，PCR法扩增目的基因fbpA；采用Southern blot检测目的基因fbpA在番茄染色体DNA中的整合情况，Western blot检测分泌型Ag85A在番茄果实中的表达情况。结果叶片煮沸快速PCR检出21株fbpA阳性转化不定芽，以番茄总DNA为模板的PCR法扩增出其中9株转化植株带有目的基因fbpA。Southern blot证实这9株番茄染色体DNA中整合了外源目的基因fbpA，Western blot检测到其中5株番茄果实中表达的卡介苗分泌型Ag85A与结核病人血清发生特异性免疫反应。结论番茄染色体DNA中整合了外源目的基因fbpA，果实中有该基因产物分泌型Ag85A表达。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的 探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值.方法 应用定量逆转录聚合酶链反应（RT.PCR）对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、30、60 d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法（CFU）作比较.结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2 d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14 d阴性的12例,治疗30 d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60 d时全部阴性.结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标.     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的　探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值。方法 应用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、306、0d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法(CFU)作比较。结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14d阴性的12例,治疗30d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60d时全部阴性。结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标。     

结核杆菌分泌性Ag85及IFN-γ在肾结核患者中的表达及意义

用免疫组织化学染色检测结核分支杆菌分泌性抗原85（Ag85）及γ-干扰素（IFN-γ）在肾结核患者（阳性对照组）及肾小球肾炎患者（阴性对照组）肾组织中的表达。结果发现,与阴性对照组比较,阳性对照组肾组织中Ag85及IFN-γ的表达明显增强;Ag85及IFN-γ二者呈直线正相关（r=0．9857,P〈0．05）。Ag85对肾结核的敏感度为100％,特异度为75％。认为Ag85在肾组织中的表达对早期诊断肾结核杆菌感染具有重要意义。