小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

携带有Foxp3基因慢病毒载体的构建及其转染大鼠T细胞的实验研究

[目的]构建携带有Foxp3基因的慢病毒载体,使之能高效地转染原代大鼠T细胞。[方法]采用PCR技术从携带有Foxp3基因的FL24796质粒扩增出Foxp3基因序列,并将其接入慢病毒载体pRRLSIN-LacZα中,经PCR、酶切和测序鉴定后,转染人293细胞和大鼠T细胞,并通过流式细胞技术观察病毒转染效果。[结果]经过PCR、酶切和测序鉴定,pLenti-Foxp3-EGFP慢病毒载体被成功构建,其转染T细胞的最佳感染复数为50︰1,所包装的病毒对大鼠T细胞的感染效率可达28.5%左右。[结论]成功地构建出携带有Foxp3基因的慢病毒载体,并能高效地转染进入原代大鼠T细胞。     

Wnt-3a/eGFP双表达基因慢病毒载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建双表达基因慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>Wnt-3a>IRES/eGFP,用携带目的基因Wnt-3a及示踪基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒转导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs),建立能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。方法基于GatewayTM技术构建双表达基因慢病毒载体,经293FT包装并释放出病毒转导rBMSCs,检测Wnt-3a以及β-catenin的表达水平。结果经测序证实目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP片段按正确方向重组入目的载体中。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清转导rBMSCs,转导率超过85%。RT-PCR证实rBMSCs-Wnt3a过表达wnt-3a和β-catenin。结论携带目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP的慢病毒可以稳定转染rBMSCs,构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

PAX2慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的 构建大鼠PAX2慢病毒表达载体,以期在大鼠肾脏中高效、稳定表达.方法 设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-PAX2中扩增小鼠PAX2基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化.用In-Fusion技术将Age Ⅰ内切酶消化后目的片段交换连接入Age Ⅰ酶切的pGC-FU载体,构建PAX2慢病毒表达载体pGC-FU-PAX2.酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-PAX2与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证PAX2在转染293T细胞中表达.结果 通过PCR扩增获得了PAX2基因,将PAX2克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论 成功构建了PAX2慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨PAX2功能奠定了基础.     

子宫颈癌细胞株表达kiss-1基因重组慢病毒的构建

目的 探讨体内表达kiss-1基因的方法 治疗子宫颈癌的可行性,构建可表达kiss-1基因的重组慢病毒.方法 采用RT-PCR方法 ,根据制备两端含有酶切位点的kiss-1基因的cDNA片段,通过常规分子生物学手段在确保信号肽酶的识别点的条件下,构建可以表达kiss-1基因的慢病毒包装专用质粒pLenti6/V5D-TOPO,与其他辅助质粒共同转染293细胞,获得能表达kiss-1的重组慢病毒.结果 测序证实克隆kiss-1的cDNA与Genebank提供的序列完全一致;经限制性内切酶物理图谱方法 证实已经成功地将kiss-1和cDNA重组到含NT4的信号肽和前导序列下游.经RT-PCR方法 证明重组慢病毒在人子宫颈癌Hela细胞中可以表达kiss-1基因.结论成功构建了能够表达kiss-1的重组慢病毒.     

小鼠GATA3基因重组腺病毒载体的构建和病毒制备

目的:在已克隆的小鼠GATA3基因基础上构建腺病毒载体,制备GATA3-adv。方法:Ad-Easy法通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒共转化BJ5183细菌,在细菌重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒,将其线性化后转染HEK293中获得有活性的包装腺病毒。腺病毒荧光检测试剂盒定量腺病毒浓度。结果:成功制备了小鼠Adv-GATA3,其浓度为3.34×109copies/ml。结论:小鼠GATA3基因重组腺病毒载体的成功构建为进一步在基因水平进行免疫紊乱性疾病的干预研究奠定了基础。     

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。     

负载ERRα基因片段慢病毒构建及表达

目的 构建编码人雌激素相关受体α(hERRα)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hERRα基因在体外的表达情况及其对人肺癌细胞A549增殖的影响。方法 采用PCR扩增hERRα基因片段,插入转移载体pW-PXLD,用磷酸钙法将pWPXLD-hERRα、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,浓缩后测定病毒滴度,再将病毒感染A549细胞,用蛋白印迹方法测定感染病毒的A549细胞中hERRα的表达。选择合适滴度的病毒感染A549细胞,采用cell-titer的方法检测感染病毒的A549细胞的活力。结果 测序结果显示成功构建了重组质粒pWPXLD-hERRα,测定浓缩后的病毒滴度为1.8×10⁸TU/mL,蛋白印迹方法检测到慢病毒感染的A549细胞中hERRα呈阳性表达;cell-titer glo检测结果表明过表达hERRα能促进细胞增殖。结论 成功构建了负载hERR基因片段的慢病毒,hERRα能在感染的A549细胞中高效表达,并促进感染病毒的A549细胞增殖。     

慢病毒载体介导的基因治疗临床研究进展

慢病毒载体具有高效、安全以及可感染非分裂细胞的优点,是一种基因治疗的重要载体。慢病毒载体介导的基因治疗已获得重大进展并已逐渐进入临床试验阶段,在对多项重要疾病的治疗中获得了显著的疗效,有望成为今后临床治疗的新手段。     

卵巢颗粒细胞高尔基体磷酸化蛋白3表达对颗粒细胞凋亡及卵母细胞发育潜能的影响

目的:探讨卵巢颗粒细胞高尔基体磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)表达对颗粒细胞凋亡及卵母细胞发育潜能的影响。方法:收集2016年5月—2017年4月因输卵管性不孕行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的80例患者的卵巢颗粒细胞,根据妊娠结局分为临床妊娠组40例、未妊娠组40例。采用免疫细胞化学、蛋白质印迹(Western blotting)方法检测2组患者颗粒细胞GOLPH3、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达,采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测2组患者GOLPH3、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表达,并进行相关性分析。结果:GOLPH3、Bcl-2、Bax、Caspase-3在2组颗粒细胞中均有表达,其中临床妊娠组GOLPH3、Bcl-2的表达高于未妊娠组(P0.05),而Bax、Caspase-3的表达低于未妊娠组(P0.05)。相关性分析显示,GOLPH3表达与Bcl-2表达呈显著正相关(P0.001),与Bax、Caspase-3表达呈显著负相关(均P0.001),与优质胚胎数、优质囊胚数、可利用胚胎数呈显著正相关(均P0.001)。结论:卵巢颗粒细胞中GOLPH3表达水平可能通过Bcl-2、Bax、Caspase-3凋亡信号转导通路调控颗粒细胞凋亡作用,并进而对卵母细胞的发育潜能产生影响。     

小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因的构建

目的构建小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因。方法 PCR扩增小鼠IL-10启动子序列,将其插入荧光素酶报告基因pGL3-basic,酶切鉴定及测序比对。结果重组体双酶切电泳后出现大小约4 800 bp与682 bp的两个片段,测序结果显示克隆的小鼠IL-10启动子序列与Genbank中的一致。结论成功构建小鼠IL-10启动子荧光素酶报告基因pGL3-IL10,为进一步研究IL-10奠定了基础。     

小鼠HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因的构建

目的构建小鼠HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因。方法 PCR扩增小鼠HMGB1启动子DNA,构建小鼠HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y。重叠延伸PCR突变HSE核心序列,构建HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T,序列比对。结果序列对比结果显示pGL3-HMGB1-Y中HSE核心碱基-TTCGAGAA-已突变为-TACGAGCC-。结论成功构建小鼠HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因,为研究热休克转录因子1对HMGB1的转录调控作用奠定了基础。     

LNG对双室培养的卵巢颗粒细胞和卵泡内膜细胞分泌功能的影响

本文采用羊膜双室培养系统,观察了18甲基炔诺酮(LNG)对猪卵巢颗粒细胞(G-C)和卵泡内膜细胞(T-C)在甾体激素生成过程中的影响。生长在羊膜两侧的G-C和T-C在加入或不加FSH、LH及各种不同浓度LNG的条件下孵育48小时,用RIA测定内、外室培养液中孕酮(P)和雌二醇(E_2)的含量,并与单独培养时的结果相比较。结果表明:①在FSH刺激时,LNG(30、3000nmol/L)明显抑制双室培养的G-C的P和E_2产量:P产量由55.1±3.4μmol/L降为25.8±1.8和20.3±3.8μmol/L;E_2产量由9.35±0.06nmol/L降至5.24±0.64和3.34±0.72nmol/L。但对P和E_2的基础水平无影响。②不论有或无LH刺激,LNG(30、3000nmoL/L)均明显抑制双室培养的T-C的P产量。有LH刺激时,P产量由70.9±6.5μmoL/L分别降为47.1±11.8和4.8±0.5μmol/L;在无LH刺激时,则由26.9±1.7μmol/L分别降至16.9±1.1和5.6±0.9μmol/L。结论:①LNG抑制双室培养中G-C的P和E_2产量,这种抑制作用是通过降低促性腺激素的刺激作用而产生的;②LNG不但抑制T-C的P基础分泌量,而且还表现为降低促性腺激素对P的刺激效应。③双室培养系统模拟了两种卵巢细胞在体时的旁分泌调节作用,与单独培养相比,是研究避孕药对卵巢功能影响的一种更为理想的模型。     

人卵丘细胞与壁颗粒细胞的差异性研究进展

颗粒细胞（granulosa cell）是卵泡内的体细胞,在卵泡的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。随着卵泡发育至窦卵泡期,颗粒细胞分化为在空间和功能上不同的2个种群,即围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞（cumulus cell）和排列在卵泡壁上的壁颗粒细胞（mural granulosa cell）。卵丘细胞主要为卵母细胞的生长发育提供营养和能量,而壁颗粒细胞主要承担内分泌功能。卵丘细胞与壁颗粒细胞不仅是位置不同,还存在功能、基因等方面的差异。迄今为止,人卵丘细胞和壁颗粒细胞在代谢组学的差异尚少见报道。综述卵丘细胞和壁颗粒细胞差异学的相关研究进展,并提出卵丘细胞和壁颗粒细胞在代谢谱表达上存在差异的新猜想,探究两者之间的差异可能为开发评估卵母细胞和胚胎质量新的标志物提供新思路,这对预测妊娠结局具有重要的临床价值。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

颗粒细胞在卵母细胞发育成熟中的作用

卵泡的发育是涉及多种细胞、多个阶段的复杂过程,其中颗粒细胞和卵母细胞是构成卵泡的重要细胞,卵泡的形成需要颗粒细胞与卵母细胞间密切的相互作用。在促性腺激素等多种激素和信号分子作用下,颗粒细胞增殖、分化,并通过间隙连接与周围的颗粒细胞、卵母细胞、膜细胞进行物质交换和信号传递,卵母细胞也可分泌多种因子反作用于颗粒细胞。颗粒细胞与卵母细胞间的相互作用涉及多条信号通路,这些信号通路间同样存在相互影响,决定卵泡的成熟或闭锁。当这些信号通路被过度激活或抑制时,可影响细胞因子的生成或传递,从而引起颗粒细胞或卵泡的凋亡,具体机制尚未明确。本文就卵泡的形成,颗粒细胞与卵母细胞、膜细胞在发育过程中的相互作用以及涉及的重要信号通路进行综述。