正交法用于真菌微卫星PCR体系优化

目的: 探讨影响真菌微卫星聚合酶链反应（SSR-PCR）的多个因素，建立PCR的最佳反应体系，为进一步进行真菌的鉴定、遗传多样性研究奠定基础。方法: 利用正交设计，从Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4 种因素，对真菌微卫星反应体系进行优化分析，并确定 PCR 适宜的退火温度及循环次数。结果: 各因素的不同水平对PCR结果都有显著 影响，其中模板DNA影响最大。在PCR反应体系中（25 μL），Taq　DNA 聚合酶 1U，模板DNA 30 ng ，dNTP 150 μmol•L^-1，引物 0.25 μmol•L^-1为最佳。 结论: 采用正交法 实验设计，对真菌微卫星PCR体系优化更科学，得出的实验体系有效范围宽，且高效、快捷。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

毛细管电泳法检测肝细胞癌微卫星基因表型的影响因素

目的：分析影响肝细胞癌微卫星—自动毛细管电泳检测结果的技术因素。方法：应用MegaBACE500毛细管电泳测序仪对一组高度多态性微卫星PCR扩增产物进行电泳，应用Genetic Profiler软件进行基因表型分型，比较PCR扩增产物在不同处理条件下对基因分型的影响。结果：PCR反应体系残留混合物(dNTP、引物和盐离子的浓度等)对基因分型的结果有明显的影响，当PCR体系中益离子和DNA的浓度比＞10000：1时可使等位基因片段分析系统评分出现偏差而导致结论错误，基因组DNA—PCR样品浓度在50ng/μl时较为合适。结论：毛细管电泳测序体系中PCR反应体系残留混合物的浓度是影响基因分型结果的一个重要因素。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

PCR-RFLP检测Apo CIII基因T-455C多态性的反应条件优化

目的:探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CIII(Apo CIII)T-455C多态性的方法。方法:采用PCR-RFLP检测ApoCIII基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响。结果:Apo CIII基因检测到3种基因型。PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响。结论:该研究建立的PCR-RFLP体系检测Apo CIII基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展。     

HBV C区基因克隆和PCR条件优化

目的 建立PCR优化条件和方法,探讨HBV C区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件.方法 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBV C区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2＋浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果 转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2＋浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6.结论 确立了HBV C区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据.     

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的 采用正交设计优化半夏SRAP - PCR的反应体系.方法 以半夏基因组DNA为模板,应用L16 (45)正交表,研究了Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果 优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg2+2...     

正交设计优化脑膜炎奈瑟氏菌PCR反应体系

目的:建立脑膜炎奈瑟氏菌PCK检测的最佳反应体系,探讨影响检测的多个因素.方法:利用正交设计,对膜炎奈瑟氏菌PCR反应体系的4因素(Taq DNA聚合酶、引物、Mg2 、dNTP)在3个水平上进行优化实验,筛选出各反应因素的最佳水平.结果:正交实验结果表明,最佳反应体系为(50μl):Taq DNA聚合酶2.0U,引物0.3μmol/L,Mg2 3.0mmol/L,dNTP100μmol/L.结论:所得体系反应稳定,正交法实验设计高效、快捷,科学性强,值得推广.     

PCR-SSP法进行HLA分型的影响因素分析

日曲：探讨DNA模板质量、DNA聚合酶(Taq)用量对人类白细胞抗原(HLA)分型结果的影响，从而确定PCR一序列特异性引物(PCR-SSP)技术的更加优化的扩增体系。方法：采用PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法，对山西地区14400名骨髓供的血样进行了人类白细胞抗原(HLA)基因分型，回顾性分析DNA模板的纯度、DNA用量、DNA聚合酶(Taq)酶用量对HLA分型结果的影响。结果：每个PCR反应的DNA模板量在30ng～50ng之间时PCR扩增效果最优；每个PCR反应所用Taq酶为0．23U时PCR扩增效果最优。结论：DNA模板量和Taq酶用量是使用PCR-SSP技术进行HLA分型的主要影响因素；模板DNA的纯度对实验结果影响不大。     

环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型

目的针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对HBV的快速检测及基因分型。方法分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测方法,并与Real-time PCR方法进行临床样本检测结果比对。结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝。与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右。结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断。     

PCR-RFLP检测Apo CⅢ基因T-455C多态性的反应条件优化

目的：探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）T-455C多态性的方法。方法：采用PCR—RFLP检测ApoCⅢ基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响。结果：ApoCⅢ基因检测到3种基因型。PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg^2＋浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响。结论：该研究建立的PCR—RFLP体系检测Apo CⅢ基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

乙型肝炎病毒基因型与干扰素及拉米夫定抗病毒治疗相关性的探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)基因型的特点,不同的基因型与干扰素及拉米夫定抗病毒治疗的反应关系。方法:通过乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR对90例HBV DNA阳性(>5×102copies/ml)、HBeAg阳性、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常的乙型肝炎病毒感染者进行HBV基因分型;对乙型肝炎病毒感染者服用干扰素或拉米夫定治疗6个月后的HBV DNA、HBeAg、ALT的变化进行分析。结果:90例HBV DNA阳性、HBeAg阳性及ALT异常患者,基因型分别检出:B型有33例(占36.6%)、C型有48例(占53.3%)、BC混合型有8例(占8.9%)和非B非C型1例(占1.1%)。33例B基因型23例服用干扰素治疗6个月后HBV感染者HBV DNA阴转率为73.9%、HBeAg血清转换率为78.3%和ALT复常率为73.7%,其余10例服用拉米夫定治疗6个月后HBV感染者HBV DNA阴转率为30.0%、HBeAg血清转换率为40.0%和ALT复常率为70.0%;48例C基因型10例服用干扰素6个月后HBV DNA阴转率为30.0%、HBeAg转换率为40.0%、ALT复常率为50.0%,其余38例服用拉米夫定6个月后HBV DNA阴转率为89.5%、HBeAg转换率为84.2%、ALT复常率为92.1%。结论:90例乙型肝炎病毒感染者基因型以B型和C型为主,C基因型为优势基因型;干扰素治疗慢性乙型肝炎患者B基因型优于C基因型。拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者C基因型优于B基因型。     

应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型(A-F)分型

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)基因型(A-F)多重PCR分型方法,并利用该方法对广东地区HBV PCR阳性血清进行分型。方法将GenBank中114例HBV 全序列进行比较分析,找出每种基因型相对于其他五种基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出六对分别针对A-F基因型的特异引物。利用这六对引物建立HBV的多重PCR分型法。结果多重PCR与以前用PCR-限制温度长度多态型分析法的分型结果一致。对广州周边地区HBV携带者的初步分型结果显示,主要为B型和C型,分别占45.00%和38.75%,另外还有16.25%的D型。结论用多重PCR分型法准确易行,灵敏性高,便于推广应用。     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

乙肝病毒基因分型检测芯片的构建及初步应用

目的:构建乙肝病毒(HBV)常见基因型的分型芯片,并应用分型芯片调查HBV基因型分布。方法:应用生物信息学软件针对乙肝病毒4种常见基因型的特征区域和保守区域分别设计分型探针和通用探针,在优化条件下通过重复杂交及分型测序检验芯片的重复性与可靠性后应用于临床,对150例不同类型的乙肝患者进行HBV基因分型。结果:分型探针和通用探针检测重现率分别为94.7%及100%,反馈的测序结果与芯片分型结果完全一致;经芯片分型发现辽宁省HBV基因型分别为C型占68.7%,B型占22.7%,B、C混合型占8.7%,未发现A、D型。结论:基因芯片技术为乙肝病毒基因分型提供了快速准确的检测方法,辽宁地区HBV基因型分布以B、C两型为主,C型占主要优势。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌两种基因分型方法的对比研究

目的 比较耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）两种基因分型方法的特点，为MRSA流行病学调查选用合适的基因分型方法提供参考。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MRSA基因高变区（Hypervariable region，HVR），并根据扩增片段大小进行基因分型，同时与ERIC-2随机引物多态性DNA分型法进行比较，并观察不同退火温度条件下两种基因分型方法的差异。结果 50株MRSA以基因高变区（HVR）分型，可分为A、B、C、DE5种基因型，其中以B（47．3％）和D（32．1％）型多见，A（3．5％）、C（10．7％）、E（6．4％）型少见，当退火温度改变时，则不能分型；用ERIC-2随机引物对MRSA进行多态性DNA分型，在低退火温度下分为10种基因型，当退火温度明显改变时，仍能分型，但每型的扩增片断明显减少。结论随机引物多态性DNA分型和HVR基因分型两种方法均能用于MRSA感染的流行病学研究，HVR基因分型PCR反应温度控制严格，分型明确；而随机引物多态性ERIC-2的DNA分型随PCR退火温度的变化而变化，应用时需严格控制PCR退火温度等反应参数，否则重复性较差。     

一种快速聚合酶链式反应方法的探究和法医学应用

目的 优化和建立一套快速聚合酶链式反应(PCR)扩增体系和程序,缩短扩增时间,提高短串联重复序列分型的速率和办案效率.方法 运用AmpFLSTR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒和7种快速扩增酶进行筛选和优化,最后对筛选出的酶优化其扩增体系和扩增程序,并对几种常规检材中提取的DNA进行扩增和检测,然后对其分型结果进行验证和讨论.结果 最终优化的扩增程序由常规的3h左右缩短至24 min,DNA检验结果与常规方法一致.结论 应用优化后的快速PCR扩增体系可以成功准确扩增DNA样本,显著提高DNA分型速率.     

兼并PCR技术反应条件的探索

[目的]探索兼并PCR技术反应的条件。[方法]依据过氧化物酶N-末端氨基酸序列设计的兼并引物,提取幼龄梨果实的DNA和RNA并将RNA反转录为cDNA,分别以DNA、cDNA和PCR产物为模板,利用PCR和琼脂糖电泳分析的方法,在不同的退火温度和引物添加量的配比下,对PCR条件进行优化。[结果]优化了PCR反应的条件,并且得到目的基因。[结论]优化后的兼并PCR技术可以更好地应用于新基因的克隆、病毒的检测等研究领域。     

中金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究药大质量观及实践

目的 建立金钗石斛Dendrobium nobile相关序列扩增多态性 (SRAP) 反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法 运用 L25(56) 正交设计对影响金钗石斛 SRAP 反应的5个因素：模板 DNA、Mg2+、dNTPs、Taq 酶、引物在5个水平上进行优化试验,对 PCR 结果进行极差分析。结果 金钗石斛 SRAP 反应最佳体系为：25 μL PCR 体系中含有 20 ng 模板 DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs, 1 U Taq 酶,0.6 μmol/L 引物。各因素对 SRAP 反应的影响依次为：〖WTBX〗Taq 酶＞Mg2+＞dNTPs＞模板 DNA＞引物。结论 所建立的金钗石斛 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。