Expression of cDNA for recombinant human granulocyte colony-stimulating factor inEscherichia coli and characterization of the protein

Objective: To determine the biological activity of rhG-CSF and it’s characterization. Methods: The prokaryotic expression vector pG01 containing human G-CSF cDNA were constructed with DNA recombination technology. Results: We had achieved high level expression of the human G-CSF inE. coli, where it represented at least 23.6% of the total protein as determined from SDS-PAGE gels. The human G-CSF was expressed as inclusion bodies inE.coli. The inclusion bodies were solubilized in a solution containing 7M urea, renatured by dialysis, isolated and purified by DEAE-sepharose CL-6B ion exchange and Superdex 75 gel filtration chromatography. The purified rhG-CSF was confirmed by coincidence of biological activity and protein demonstrated by SDS-PAGE. It was homogeneous with respect to mol. Wt (18400). The purity of the rhG-CSF might be >90 per cent. Conclusion: The purified rhG-CSF in our laboratory had dramatically the biological activity of regulating proliferation and differentiation of the human G-CSF-dependent cell line NSF-1 and the progenitor cells of granulocytes of human bone marrow.     

重组人白细胞介素17的原核表达、纯化及鉴定

目的:优化重组人白细胞介素17的原核表达条件,选择不同的路线进行分离纯化.方法:利用SDS-PAGE方法分析比较重组人白细胞介素17在不同培养基、不同诱导时间的表达量,选择最适条件,大量扩增后,分离出包涵体,分别采用盐酸胍溶解法和SDS溶解法两条纯化路线进行进一步的分离和纯化,并对所纯化产物进行常规分析鉴定.结果:采用上述两种不同的溶解包涵体方法,通过后续复性及纯化,均可得到高纯度具有生物学活性的重组IL-17.采用SDS溶解法具有较高的得率,采用盐酸胍溶解法纯化得率较低,得产物的生物学活性较高.结论:通过表达及纯化,得到了大量高纯度具有活性的rhIL-17,为进一步研究IL-17的体内外生物学效应打下了基础.     

提高bFGF基因表达水平的策略及其表达产物的纯化工艺

目的通过在同一个表达载体pLX1上调整SD序列和ATG之间距离,以提高bFGF目的蛋白表达量。方法以Klenow和MungBeanNuclease通过增加2个及减少2个碱基调整SD序列和ATG之间距离,SDS-PAGE和Westernblot检测目的蛋白表达量,以高压液相疏水层析、凝胶过滤及肝素亲和层析纯化目的蛋白、MTT法进行活性测定。结果获得了重组质粒pLX2,pLX3,诱导后与表达质粒pLX1（7.78%）相比,表达量分别为8.03%,9.9%,经纯化后获得的bFGF纯度达98%,ED50为2.29ng/ml。结论调整SD序列和ATG之间距离可以增加目的基因的剂量,从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。     

抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达

目的　构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0并在大肠杆菌中表达。方法　从质粒pVC85中克隆出PE4 0基因 ,与抗胶质瘤单链抗体SZ39 ScFv基因进行拼接 ,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0基因 ,并将其克隆于表达载体pET2 0b( ) ,在大肠杆菌Bl2 1(DE3)pLysS中以IPTG诱导表达。结果　SDS PAGE分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在 ,分子量为 6 8kD左右 ,与SZ39(ScFv) PE4 0的分子量理论推算值相符 ;Westernblot显示在 6 8kD处出现特异性显色印迹 ;凝胶灰度扫描显示其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。结论　重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0可经原核表达载体 ,pET2 0b( )在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中以包涵体形式得到较高效率的表达。     

人源化抗肝癌scFv融合RC-RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用

目的 :在大肠埃希菌中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC RNase(scFv RC RNase) ,观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的杀伤作用。方法 :将原核表达质粒Tih scFv RC RNase以大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )为宿主菌 ,用异丙基硫代 -β -D -半乳糖苷 (IPTG )诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后 ,上清液用Ni NTAAgarose亲合层析法进行纯化。四甲基噻唑蓝 (MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的体外杀伤作用。结果 :IPTG诱导 5h后 ,SDS PAGE显示抗肝癌scFv RC RNase在大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )中主要以可溶性的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白量的 10 5 %。MTT法提示 ,纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1具有一定的杀伤作用 ,其半数致死量 (LD50 )为 0 0 0 7g/L。结论 :抗肝癌scFv RC RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物。     

人白血病细胞系J6-1变异M-CSF的表达及受体结合活性研究

目的：从人白血病细胞系J6－1克隆并表达变异的M－CSF的功能区，研究其受体结合活性。方法：RT－PCR克隆muM-CSF并在大肠杆菌BL21trxB(DE3),pET32c( )系统中表达；镍柱鏊合层析，抗体亲和层析纯化。ELISA法测定其受体结合活性和解离常数，并测定对J6－1细胞增殖刺激的活性。结果；muM-CSF可在本文实验系统呈可溶性表达，纯化产物具有M－CSF受体的结合活性，解离常数为3.7nmol/L低于正常M－CSF，且刺激细胞体外增殖能力大于正常M－CSF。结论：从人白血病细胞系J6－1克隆的muM-CSF能在BL21，pET32c( )系统表达，可得电泳纯产物。     

死亡受体5胞外区域的重组、表达及活性鉴定

目的: 构建死亡受体5(death receptor 5,DR5)胞外区域(eDR5)的表达载体,表达纯化重组蛋白并鉴定其生物特性.方法: 通过重叠 PCR 获得 DR5 胞外段编码序列,构建 pET-22b( )/DR5 表达载体,转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG 诱导表达,Ni2 柱亲和纯化,SDS-PAGE、直接 ELISA 鉴定纯化产物的纯度和特异性,用 MTT 法检测eDR5 蛋白阻断DR5 单克隆抗体 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343(高表达DR5)、U373(低表达DR5 )细胞凋亡的作用.结果: 获得了 DR5 胞外段编码序列,目的蛋白在上清及包涵体中都有表达, 表达量占菌体总蛋白的 30% 以上,纯化的重组蛋白纯度达 95% 以上,蛋白产量达 9 mg/ml.ELISA 结果表明所纯化蛋白为eDR5.eDR5 蛋白可部分阻断 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343 细胞凋亡的作用,其阻断率与 DR5 表达相关.结论: 死亡受体 5 胞外段基因的成功重组、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础.     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

rhG-CSF对Ara-C杀伤急性髓性白血病细胞影响的实验研究

目的探讨ｒｈＧ－ＣＳＦ对２１例急性髓性白血病（ＡＭＬ）细胞体外对阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）敏感性的影响。方法采用ＭＴＴ法检测Ａｒａ－Ｃ的细胞毒作用。结果ｒｈＧ－ＣＳＦ可显著增强Ａｒａ－Ｃ对耐药ＡＭＬ细胞的毒性,与对照组相比Ｐ＜０．０５;结论ｒｈＧ－ＣＳＦ可能通过促进耐药ＡＭＬ细胞进入增殖周期,而增强Ａｒａ－Ｃ对耐药ＡＭＬ细胞的毒性,从而具有耐药的逆转效应,预示着ｒｈＧ－ＣＳＦ与Ａｒａ－Ｃ联合运用治疗耐药ＡＭＬ的潜在价值     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

rhG-CSF对正常供者淋巴细胞亚群及其活化的影响

 目的　研究人重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)对供者淋巴细胞亚群及其表面活化标志的影响。方法　应用流式细胞术检测 2 2例异基因造血干细胞供者rhG CSF动员前、中、后外周淋巴细胞亚群的比例及T淋巴细胞活化指标的变化。结果　rhG CSF动员第 4天 ,淋巴细胞数、B淋巴细胞、CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 细胞绝对值均明显升高 ;CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 细胞的比例及CD4 /CD8值动员前、中、后无明显变化。除CD4 + CD2 5 + 、CD4 + CD4 5RO+ 表达动员后降低外 (且于动员停止后第 7天恢复至动员前水平 ) ,其余活化标志的表达无明显变化。结论　rhG CSF可暂时性升高正常供者的淋巴细胞数及降低T淋巴细胞活化水平 ,但于停止动员后 1周恢复至动员前水平     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.     

小细胞肺癌抗独特型单链抗体的表达及活性研究

目的:在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法:从SCLC抗独特型抗体3F6小鼠杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录为cDNA。利用小鼠抗体骨架区共用引物,PCR扩增单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过人工设计的柔性连接肽(Gly4Ser)3连接构建3F6ScFv。再将其重组到原核表达载体pQE31中,构建3F6ScFv表达载体。转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,用NiNTA树脂对表达产物进行变性纯化。通过凝胶(SephacrylS200)柱上在位复性后,用竞争ELISA检测复性的3F6ScFv活性。结果:获得了SCLC抗独特型抗体3F6的VH和VL基因,构建了3F6ScFv表达质粒。在大肠杆菌中高效表达3F6ScFv,表达蛋白的相对分子质量为32×103,以包涵体形式存在。纯化后获得较纯的3F6ScFv蛋白,经复性后可竞争2F7抗体与SCLCNIHH128细胞结合。结论:成功构建、表达、纯化和复性了SCLC抗独特型抗体3F6ScFv,获得有活性的3F6ScFv,为SCLC抗独特型抗体的进一步研究奠定了基础。     

小细胞肺癌2F7单抗ScFv的高效表达及复性研究

目的 在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体（ScFv)，并获得具有生物学活性的ScFv。方法 利用PCR方法将2F7单抗重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一人工设计的柔性连接肽（Linker)连接，再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中，构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv。将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达，并对表达产物进行纯化和稀释复性。结果 获得了2F7单链抗体的高效表达，表达蛋白大小约27.4kD，以包涵体形式存在。包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后，获得了有功能的单链抗体。结论 成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗F27的单链抗体，并对其进行了纯化和复性，将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用。     

G-CSP基因治疗对大剂量化疗后结肠癌小鼠中性粒细胞数量和功能的影响

中性粒细胞作为一种重要效应细胞在机体抗肿瘤过程中发挥重要的作用。为了探讨G-CSF基因治疗及大剂量化疗后对荷瘤小鼠中性粒细胞的影响以及G-CSF基因治疗后中性粒细胞在抗肿瘤中所起的作用,我们对G-CSF基因治疗后荷瘤小鼠中性粒细胞的数量和功能进行了研究。结果发现,G-CSF基因治疗与重组G-CSF(rhG-CSF)注射疗法相比,能更明显地提高结肠癌小鼠中性粒细胞的数量、中性粒细胞的吞噬功能、杀伤C-26细胞的活性以及分泌IL-1、TNF、NO水平。对大剂量化疗后的结肠癌小鼠,仍能明显提高中性粒细胞数量、吞噬功能、杀伤C-26结肠癌细胞的活性以及分泌IL-1、TNF、NO水平。表明G-CSF基因治疗比rhG-CSF注射疗法更有效地纠正并提高由于大剂量化疗后引起的外周血中性粒细胞的降低,增强中性粒细胞的杀伤活性,促进中性粒细胞分泌IL-1等细胞因子,发挥直接或间接的抗肿瘤作用。     

EGF-Ang融合蛋白的构建、表达及活性研究

目的：构建由人表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和人血管生成素（angiogenin, Ang）组成的人源化的融合蛋白，并检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤能力。方法：利用基因工程技术将EGF和Ang基因连接起来，克隆到高效表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pEGFAng，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白（EGFAng）。经DEAESepharose FF阴离子交换柱层析纯化后，用MTT法检测复性蛋白的细胞毒性。结果：SDSPAGE和薄层扫描分析表明外源蛋白的表达量占菌体裂解蛋白总量的18.6%。细胞活性检测表明EGFAng重组蛋白能明显地抑制Hep2细胞的生长，而不影响MA104细胞的正常生长。结论：融合蛋白EGFAng在体外对过度表达EGFR的Hep2细胞具有明显的杀伤作用。     

A factor from plasma-derived human serum that inhibits the growth of the mammary cell line MCF-7: characterization and purification

A protein that inhibits the replication of a malignant human mammary cell line, MCF-7, was purified to apparent homogeneity from human plasma-derived serum (PDS). Serum fractionation was accomplished by molecular sieve chromatography on Sephadex G-100 and Sephadex G-100 superfine columns. Further purification was accomplished by ion-exchange chromatography, with the use of DEAE-Sephacel followed by preparative polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under nondenaturing conditions. Active fractions analyzed by sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE showed one band with an apparent molecular weight of 53,000. Assays for the stability of those PDS fractions with the greatest growth-inhibitory activity and specificity for MCF-7 cells revealed that activity was retained during incubation at pH 2-10. Exposure to 6 M urea also had no effect on inhibitory activity. The activity was significantly reduced by incubation at 70 degrees C for 1 hour, exposure to 0.1% SDS, and treatment with chymotrypsin. Isoelectrofocusing showed two isoelectric points, 5.1 and 6.8.     

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

重组人GST/MCP-1融合蛋白纯化及其抗肿瘤作用的研究

从高表达GST/MCP-1的菌株纯化GST/MCP-1,其表达产物以包涵体形式存在.包涵体经分离洗涤后,探索了对其变性复性的最佳条件.复性后的样品经Glutathione Sepharose 4B一步亲合层析纯化,获得了具有生物学活性的SDS-PAGE纯的GST/MCP-1.Western Blot检测表明,纯化的GST/MCP-1可与MCP-1抗体发生特异反应.体外抗肿瘤试验表明,CST/MCP-1激活单核细胞及淋巴细胞后,具有抑制肿瘤细胞生长的能力.裸鼠抗肿瘤试验同样显示明显的抑制反应.上述结果提示MCP-1具有抗肿瘤能力.