临床血液标本中18株弯曲菌的菌种与特征分析

目的了解临床血液标本中分离的18株弯曲菌的菌种类型与特征。方法按常规生化实验、16S rRNA基因和rop B基因测序技术对分离株进行种型鉴定,结合鉴定结果、生长属性和临床资料分析其病原学特征。结果 18株血流感染的病原菌均为革兰阴性逗点样弯曲或螺旋样弯曲的弧形菌。经16S rRNA基因和rop B基因测序分析,共有13株胎儿弯曲菌龟亚种、1株胎儿弯曲菌胎儿亚种,2株空肠弯曲菌空肠亚种,1株大肠弯曲菌和1株海鸥弯曲菌。临床资料显示,弯曲菌血流感染主要对象为新生儿和有基础性疾病患者(如肝炎、糖尿病、高血压),大多不伴随腹泻症状。体外存活实验显示,胎儿弯曲菌相对于空肠弯曲菌、大肠弯曲菌等具有较强的生存能力,其在含血液的血培养瓶中可存活一年以上。结论胎儿弯曲菌龟亚种可能是我国弯曲菌血流感染的主要菌型。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

深圳市南山区腹泻患者弯曲菌感染及病原学特征分析

目的获得本地区秋季腹泻患者弯曲菌的感染现状及病原学特征。方法收集深圳市南山区2018年9 — 11月腹泻患者的粪便标本,采用双孔滤膜法分离培养弯曲菌并应用荧光聚合酶链式反应（PCR）方法进行菌种鉴定。 应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对分离菌株进行分子分型,应用琼脂稀释法获得菌株对11种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。 根据菌株的序列分型（ST）结果,结合既往菌株分型数据进行本地区菌株的遗传聚类分析。结果共采集腹泻患者粪便标本150份,其中男性患者74例,女性患者76例,年龄在1～86岁之间。 150份粪便标本中共分离到弯曲菌18株,检出率为12.00%（18/150）。 菌种鉴定发现,空肠弯曲菌占77.78%（14/18）,结肠弯曲菌占22.22%（4/18）。 14株空肠弯曲菌可分为11种PFGE带型,8个ST型别,以ST9763最多（35.71%,5/14）,是本研究新发现ST型别。 14株空肠弯曲菌对四环素全部耐药,对红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、庆大霉素、链霉素及克林霉素100.00%敏感。 ST型别最小生成树聚类分析结果表明,不同宿主来源菌株没有显著聚集性,腹泻患者分离菌株分布在不同来源的组群中。结论采用双孔滤膜法提高了腹泻患者中弯曲菌的检出率。本地区弯曲菌的感染仍以空肠弯曲菌为主, 分离菌株对四环素类、喹诺酮类抗生素呈现较高的耐药特征,分离的空肠弯曲菌ST呈弥散分布特点。     

深圳地区不同来源空肠弯曲菌毒力基因分布及分子分型研究

目的 了解深圳地区市售禽类食品和腹泻病人中分离的空肠弯曲菌毒力基因分布及其分子分型情况。方法 根据特异性引物,运用聚合酶链式反应(PCR)检测空肠弯曲菌4种毒力基因(cdtB,cadF,flaA,virB11),应用脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)对空肠弯曲菌分离株进行分子分型。结果 3种毒力基因在禽类食品分离株(5株)和腹泻病人分离株(5株)的分布情况一致,均携带cdtB和cadF,但均未检出virB11,两种来源菌株flaA的检出情况分别为3/5和2/5; PFGE聚类分析图谱显示,10株空肠弯曲菌经Sam I 酶切后可分别产生5～9条DNA条带的PFGE带型,其中食品株与病人株之间部分存在高度同源,同源性达到85%以上,但高度同源的菌株之间携带flaA毒力基因的分布不同。结论 深圳地区空肠弯曲菌存在cadF,cdtB,flaA等3种毒力基因,不同来源菌株之间同时具备多样性和同源性,提示空肠弯曲菌腹泻病人的感染来源可能与受污染的禽类食品密切相关,为该地区食源性空肠弯曲菌腹泻病提供基础性资料和依据。     

2016-2018年湖南省株洲市弯曲菌的流行特征及耐药性分析

目的了解湖南省株洲市弯曲菌的流行病学现状和耐药特征。方法2016年7月至2018年6月,在株洲市对腹泻病例和无腹泻症状儿童开展流行病学调查,并采集粪便标本进行弯曲菌的分离培养和耐药性分析。结果共调查人群粪便标本450份,弯曲菌的检出率为6.44%(29/450),其中无腹泻症状儿童的检出率为1.00%(1/100),腹泻病例的检出率为8.00%(28/350)。弯曲菌感染的临床症状以腹泻、腹痛、黏液便、粪便镜检均有红、白细胞为主;5~岁组检出率较高,为19.44%(7/36);学生的检出率最高,为17.65%(6/34);男、女性患者的检出率差异无统计学意义(χ2=1.354,P=0.245);春秋季弯曲菌的检出率高于夏冬季。29株弯曲菌中24株为空肠弯曲菌,5株为结肠弯曲菌,其中41.38%的菌株为多重耐药菌株,菌株对萘啶酸、环丙沙星和四环素的耐药性较强,分别为96.15%、88.46%、76.92%。结论空肠弯曲菌、结肠弯曲菌感染已成为株洲市感染性腹泻的重要病原菌之一,耐药性严重并存在多重耐药现象,应加强弯曲菌的监测和防控。     

中国羊种布鲁氏菌<I>omp2</I>基因PstⅠ酶切多态性特征分析

目的拟发现中国羊种布鲁氏菌Iomp2/I基因PstⅠ酶切多态性特征。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对羊种标准菌株、疫苗株M5、国内分离的羊种布鲁氏菌野毒株及非典型株共46株进行分析。结果Iomp2/I基因扩增产物经PstⅠ酶切后呈现两种酶切图谱,43/46有238 bp和44 bp 2个条带;仅羊1型标准株16M和两株青海非典型羊种1型菌有282 bp、238 bp和44 bp 3个条带。结论Iomp2/I基因PstⅠ酶切可为区分部分野生动物中的羊种菌和家畜羊种菌,为揭示布鲁氏菌的遗传衍化关系提供线索。     

鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌聚合酶链反应方法的建立及应用

目的建立鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌IctrA/I基因变异区序列,设计合成PCR引物,分别用于扩增29E群、X群和Z群等3个血清群脑膜炎奈瑟菌。并将该方法应用于41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本的检测。结果3对引物分别能够特异性PCR扩增29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株的IctrA/I基因,扩增片段大小分别为667 bp、525 bp和667 bp,3个血清群之间以及与其他血清群脑膜炎奈瑟菌之间未出现交叉PCR扩增。41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本中,29E群和X群PCR阳性的标本分别有7份和2份,未检测出Z群菌株。结论本研究建立的PCR方法能准确、特异地鉴定29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

感染性腹泻患者弯曲菌感染的实验室检测及监测

目的了解我国腹泻患者弯曲菌的感染现状。方法采用体外分离培养以及特异核苷酸检测法对某医院腹泻患者粪便标本进行持续8个月的弯曲菌感染的监测。2013年4-11月持续收集北京某医院感染性腹泻门诊患者粪便标本278份,分别采用直接划线培养、增菌培养以及实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)的方法检测感染性腹泻患者弯曲菌的感染现状。结果 278份感染性腹泻患者粪便标本使用分离培养和特异核苷酸检测共有16份标本为空肠弯曲菌阳性。其中直接划线培养分离到6株空肠弯曲菌,阳性率为2.2%(6/278),增菌培养分离到2株空肠弯曲菌,阳性率为0.7%(2/278);特异核苷酸检测获得14份阳性标本,阳性率为5.0%(14/278)。分离培养、real-time PCR方法检测感染性腹泻患者粪便标本中弯曲菌的阳性率差异有统计学意义(χ2=36.425,P=0.039)。结论本次检测结果表明感染性腹泻患者中弯曲菌的检出率显著低于国内最新报道7.1%。与直接分离培养相比,增菌培养法检测粪便中弯曲菌的灵敏度显著降低。real-time PCR法能够快速检测腹泻患者弯曲菌的感染情况,其灵敏度(14/16,87.5%)高于分离培养(6/16,37.5%)。     

两种消毒剂对分枝杆菌杀灭效果的比较

摘要 目的 比较两种消毒剂对分枝杆菌的杀灭效果,为实际消毒应用提供依据。方法 采用悬液定量杀菌试验方法,对某聚维酮碘和二氯异氰尿酸钠杀灭几种分枝杆菌标准株的效果进行比较实验。结果 用含有效碘250 mg/L消毒剂作用1 min,对悬液内龟分枝杆菌脓肿亚种杀灭对数值＞4.00;用含有效碘500 mg/L消毒剂作用1 min,对悬液内结核杆菌H37Rv株和H37Ra株的杀灭对数值均＞4.00。用含有效氯1 000 mg/L消毒剂作用2.5 min,对悬液内龟分枝杆菌脓肿亚种的杀灭对数值＞4.00;含有效氯1 000 mg/L和2 000 mg/L消毒剂作用10 min,对悬液内结核杆菌H37Rv株和H37Ra株的杀灭对数值均＞4.00。标准菌株H37Rv杀灭对数值＞4.00。结论 杀灭龟分枝杆菌和结核杆菌H37Rv株与H37Ra株所需含氯消毒剂浓度和作用时间均高于聚维酮碘。     

多重聚合酶链反应鉴别单核细胞增生李斯特菌的研究

目的：建立一种快速有效地鉴定李斯特菌属和鉴别单核细胞增生李斯特菌（Lm)的方法。方法：以具有李斯特菌种、属特异性的iap基因和Lm特异的溶血素基因（hlyA)为靶目标，分别设计双重聚合酶链反应（PCR）和三重PCR鉴别李斯特菌，并比较2种PCR方法的特异性。结果：双重和三重PCR方法检测李斯特菌属和Lm标准株，均具有良好的特异性：进行三重PCR检测，可出现3个条带，其中2条为Lm的特征性条带（700，4200bp)，另1条为其他李斯特菌的iap基因片段（1200bp)，但是双重PCR不能鉴别部分Lm食品分离株，而三重PCR则可以鉴别。结论：建立的三重PCR法可用于李斯特菌属细菌特异性鉴定和混合培养物中Lm的特异性鉴别。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的双重荧光PCR方法的建立和评价

目的 建立一种检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的双重荧光PCR方法.方法 设计针对艰难梭菌gyrA基因的特异性引物,并针对莫西沙星耐药株和敏感株的gyrA基因突变位点设计不同的TaqMan-MGB探针,优化可同时检测ATT、ACT突变点的双重荧光定量PCR方法,验证该方法的灵敏性、特异性和重复性,并进行应用评价...     

恙虫病东方体环介导等温扩增可视化快速检测方法的建立

目的 利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术,建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法 利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4,以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列,设计扩增引物,优化反应条件。利用恙虫病东方体标准株评估灵敏度和特异度;收集42份恙虫病血样,分别采用LAMP、普通PCR和实时荧光定量PCR方法进行验证。结果 建立的LAMP方法可在61～65℃80 min内完成恙虫病东方体的快速检测,最低检测限为10拷贝/μL,高于普通PCR方法 2个数量级,高于荧光定量PCR方法 1个数量级;对8种常见的自然疫源性疾病病原体检测均为阴性,特异度为100%;对42份恙虫病血样采用3种方法检测,阳性率一致,均为21.4%(9/42)。结论 本研究建立的恙虫病东方体LAMP可视化检测反应快速,操作简便,灵敏特异,可在基层医疗卫生机构运用推广。     

黄疸出血群钩端螺旋体LAMP-LFB快速检测方法的建立与应用

  目的   基于环介导恒温扩增（LAMP）结合纳米生物传感条（LFB）技术,建立并评价黄疸出血群钩端螺旋体（钩体）的LAMP-LFB快速检测方法。  方法   以黄疸出血群钩体O抗原基因簇中的糖基转移酶基因（gtf）为检测靶标并设计特异性LAMP引物。 通过对LAMP引物的特定标记（FIP-FAM和LF-Biotin）和优化试验,建立LAMP-LFB快速检测方法,并分析其灵敏度和特异性。 应用建立的LAMP-LFB、普通PCR方法和显微凝集试验（MAT）,分别对53株钩体分离菌株进行鉴定,比较分析鉴定结果并评价LAMP-LFB方法的实用性。   结果   灵敏度和特异性试验显示,LAMP-LFB方法可检出黄疸出血群赖型56601基因组DNA的最低浓度为100 fg/μL,检测特异性为100%,与其余血清群和非钩体菌株核酸无交叉反应。 菌株鉴定结果显示,LAMP-LFB与MAT鉴定结果完全一致,符合率为100%,其敏感性高于PCR方法。 此外,LAMP扩增产物经LFB验证,可直接通过观察检测线（TL）和质控线（CL）进行结果判定。  结论   基于gtf基因建立的LAMP-LFB检测技术方便、快捷且重复性好,可快速、灵敏、特异地鉴定黄疸出血群钩体菌株,能够作为有价值的黄疸出血群钩体菌株快速鉴别或诊断方法。     

一株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌的鉴定和药物敏感性特征分析

目的 鉴定1株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌并对其耐药特征及机制进行分析.方法 基于肠道病原监测平台收集的分离于2015年的沙门菌株使用生化检测试验和血清凝集试验进行病原体鉴定和血清型分型,并用聚合酶链式反应方法检测mcr-1基因;使用微量肉汤稀释法进行药敏试验;使用质粒图谱和Southern-blot试验对菌株耐药基...     

不同方法提取血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌核酸的比较

目的 比较不同提取方法对血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌检出率的影响。方法 将定量检测的灭活菌液/基因组DNA梯度添加至含抗凝血的血培养瓶中,选择不同的方法提取核酸,利用荧光定量检测其含量。结果 磁珠法和裂解法最低能检测添加10² CFU/mL的灭活菌液以及10-3 ng/μL的基因组DNA;离心柱法无法检测未经红细胞裂解液处理的添加10⁶ CFU/mL的灭活菌液以及10 ng/μL的基因组DNA,经红细胞裂解液处理后也只能检测到添加10⁴ CFU/mL的灭活菌液以及1 ng/μL的基因组DNA的模拟样品。结论 红细胞裂解液处理模拟样品能够增加核酸的提取量,裂解法提取效果最好,其次是磁珠法,再次是离心柱法。本研究为疑似布鲁氏菌病样品血培养物的核酸检测提供了方法参考,为提高布鲁氏菌病的诊断率提供了新的思路。     

基于基因组序列的3种沙门菌分子血清分型方法比较研究

目的 比较3种沙门菌分子血清分型方法,获得一种准确度较高的方法用来替代传统的血清凝集技术用于沙门菌血清型判定.方法 对覆盖50个血清型的509株沙门菌提取核酸进行全基因组测序,根据全基因组序列分别利用多位点序列分型(MLST)、SalmonSeroPredicition 以及 SISTR(Salmonella in s...     

宏基因组测序在腹泻暴发调查中的应用

目的 评价宏基因组测序技术在腹泻暴发中的潜在应用价值.方法 收集2017年报告的2例聚集性腹泻暴发事件的样品,针对样品进行多重荧光PCR检测;同时,应用宏基因组测序技术对样品进行测序,基于测序数据分析暴发事件的病原体.结果 案例1采用多重荧光PCR检测,仅检测到副溶血弧菌;而采用宏基因组测序技术除检测到副溶血弧菌外,还...     

河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇中vgrG操纵子的调控研究

  目的  探究河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇hcp-vgrG中vgrG操纵子的调控。   方法  使用荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测野生株和VfqI-VfqR系统缺失株中vgrG的mRNA水平。 利用启动子-lux报告质粒系统检测冷光值,确定vgrG启动子在河弧菌野生株、缺失株、回补株中的活性差异。 在大肠埃希菌中,导入VfqR过表达质粒,检测vgrG启动子-lux报告质粒冷光值,确定VfqR可否激活vgrG启动子。  结果  ?vfqI、?vfqR和?vfqI-vfqR缺失株中vgrG mRNA水平和启动子活性均显著低于野生株;在?vfqR中回补VfqR表达质粒pSRvfqR和在?vfqI中分别添加3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₀-HSL和3-oxo-C₁₂-HSL AHLs分子均能恢复vgrG启动子活性,并且3种AHLs分子效果大体一致。 在大肠埃希菌中过表达VfqR并添加上述3种外源AHLs,对vgrG启动子活性没有影响。  结论  VfqI-VfqR密度感应系统在启动子水平正性调控vgrG操纵子,并且该调控作用是间接的。     

粪便样本中志贺菌分离培养方法的优化

目的 优化从腹泻患者粪便标本中分离培养志贺菌的方法.方法 使用EC肉汤和志贺菌增菌液对129份粪便样本进行增菌培养,采用普通PCR方法检测ipaH基因,使用木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂(XLD)培养基、麦康凯琼脂(MAC)以及沙门志贺菌培养基(SS)等选择性培养基分离培养志贺菌.使用志贺菌参考菌株,进行模拟增菌培养,利用荧...