DPC4基因通过mTOR信号通路诱导胰腺癌细胞自噬

目的验证过表达DPC4基因对胰腺癌细胞增殖侵袭的抑制作用,探讨mTOR信号通路对其激活自噬的调控作用。方法构建DPC4过表达载体,转染胰腺癌JF305细胞,CCK-8、Transwell检测其对胰腺癌JF305细胞的增殖侵袭能力,透射电镜观察自噬小体,Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1的表达。结果过表达DPC4可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭;激活自噬,电镜下DPC4过表达细胞中自噬颗粒明显增多;自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ在过表达DPC4的JF305细胞中表达升高,同时下调p-mTOR和p-4EBP1的表达水平。结论 DPC4基因可以抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,其作用机制与抑制mTOR信号通路、激活自噬相关。     

miR-206在大鼠肺动脉高压模型中的表达和意义

目的 探讨miR-206在大鼠肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）模型中的表达和意义。 方法 构建肺动脉高压大鼠模型，按缺氧暴露时间分别标记为(1、7、14、21和28 d)组，并将常压常氧（FIO₂为0.21）作为对照组（n = 5），提取大鼠右下肺叶组织及外周血，实时定量PCR检测miR-206表达；分离大鼠原代肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC），以miR-206 mimics转染细胞并进行缺氧暴露，检测细胞增殖能力。生物信息学分析发现并选择缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α作为miR-206的候选靶基因，以双荧光素酶报告实验验证miR-206是否可直接调控HIF-1α，共转染miR-206mimics与HIF-1α过表达质粒，检测PASMC细胞增殖能力变化。 结果 与对照组相比，大鼠肺组织中miR-206的表达在缺氧暴露后即可出现miR-206表达降低（P < 0.05），大鼠血清miR-206亦明显降低（P < 0.05）；缺氧暴露后的大鼠肺组织分离培养的PASMC miR-206表达与对照组相比也明显降低（P < 0.05），miR-206低表达时PASMC增殖能力明显增加（P < 0.05）；miR-206 mimics转染可拮抗因缺氧暴露引起的PASMC增殖能力增加（P < 0.05）。生物信息学发现HIF-1α的3’非编码区（3’ untranslated region，3'UTR）具有miR-206的结合位点，用miR-206和HIF-1α（野生型3'UTR）共转染的PASMC中荧光素酶报告基因活性较对照组显著下调（P < 0.05），而miR-206 mimics和HIF-1α（突变型3'UTR）共转染组则较对照组无明显统计学差异。共转染miR-206 mimics后，HIF-1α上调引起的细胞增殖被逆转（P < 0.05）。 结论 缺氧诱导的miR-206下调通过靶向PASMC中的HIF-1α途径来促进PH，miR-206可能是缺氧诱导PH早期的触发因素。     

鲍曼不动杆菌诱导Raw 264.7细胞自噬研究

目的 探讨鲍曼不动杆菌诱导鼠巨噬细胞Raw 264.7发生自噬的能力方法 鲍曼不动杆菌标准株(ATCC 17978)感染Raw 264.7细胞,于感染180 min时中止实验,收集细胞提取总RNA和总蛋白,通过Western boltting法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达。同时通过qPCR法检测自噬相关基因atg3、atg4B、atg5、atg7、atg12、atg16L1、ULK1和GABARAPL1。结果 鲍曼不动杆菌感染Raw 264.7细胞后,细胞LC3和Beclin-1表达量较未感染组升高显著(F_(LC3)=457.2;F_(Beclin-1)=43.27,P＜0.01),自噬相关基因表达量atg3、atg4B、atg5、atg7、atg16L1、ULK1、GABARAPL1变化并不明显,而atg12表达量在180 min时升高显著(F=208.6,P＜0.01)结论 鲍曼不动杆菌可以诱导鼠巨噬细胞Raw 264.7发生自噬,其机制可能是通过ATG12- ATG7- ATG5信号传导通路,但其确切机制有待于进一步研究。     

miR-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

目的探讨微小RNA(miR)-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的调控作用及相关分子机制。方法将HUVECs随机分为正常组,ox-LDL组,阴性对照组,anti-miR-24组,miR-24组。正常组细胞正常培养,ox-LDL组细胞用100μg/ml ox-LDL作用6 h诱导自噬,阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组先分别转染相应慢病毒载体,再以同法诱导自噬。实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)验证miR-24慢病毒稳转细胞株构建情况及ox-LDL对HUVECs内miR-24表达的影响;透射电镜观察各组细胞内部自噬小体和自噬溶酶体的数量;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞活性;Western印迹与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后miR-24的表达受到影响;ox-LDL可诱导下调miR-24在HUVECs中的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,anti-miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著增加(P<0.05),但细胞活性无显著差异(P>0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著增高(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量降低(P<0.05)。然而,miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低(P<0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量升高(P<0.05)。结论过表达miR-24可通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs自噬进而抑制细胞增殖,miR-24可能成为动脉粥样硬化(AS)的潜在治疗靶点。     

糖尿病胃瘫大鼠胃窦平滑肌自噬相关蛋白的动态变化及其意义

目的 观察糖尿病大鼠胃窦平滑肌自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的变化,探讨其在糖尿病胃动力障碍发生过程中的意义。 方法 将大鼠分为模型2周（DM2w）、模型4周（DM4w）和正常对照（NC）组,检测各组胃窦平滑肌Beclin-1和LC3蛋白表达。 结果 与NC组相比,DM2w、DM4w组胃窦平滑肌Beclin-1蛋白相对表达量均较高[（0.13±0.04）vs（0.22±0.12）,P〈0.05;（0.13±0.04）vs（0.62±0.07）,P〈0.01],且DM4w组高于DM2w组[（0.62±0.07）vs（0.22±0.12）,P〈0.01]。LC3蛋白显示LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两条带,与NC组相比,DM2w、DM4w组胃窦平滑肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均较高[（0.98±0.09）vs（2.28±0.20）,P〈0.01;（0.98±0.09）vs（2.34±0.21）,P〈0.01],DM2w组与DM4w组比较差异无统计学意义[（2.28±0.20）vs（2.34±0.21）,P〉0.05]。 结论 自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达在糖尿病胃动力障碍发病前随病程逐渐加强,自噬可能影响糖尿病胃动力障碍发生。     

饥饿诱导胃癌细胞自噬发生及Beclin-1表达的变化

目的探讨饥饿诱导胃癌细胞MKN1自噬的发生及自噬相关蛋白Beclin-1表达的变化。方法培养胃癌细胞MKN1至对数生长期后,以无氨基酸培养液EBSS代替RPMI1640培养液培养细胞,培养12h后收集细胞,应用Western印迹和定量PCR(qRT-PCR)方法分别检测特异性标记自噬的微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)以及自噬相关蛋白Beclin-1的蛋白和mRNA表达。免疫荧光检测饥饿诱导后细胞自噬体的产生。结果饥饿处理12 h后,Western印迹和qRT-PCR检测LC3B和Beclin-1蛋白和mRNA表达与对照组比较均明显增加(P0.05)。免疫荧光下可见点状自噬体。结论饥饿可以诱导胃癌细胞MKN1发生自噬,Beclin-1与饥饿诱导胃癌细胞MKN1的自噬相关,为进一步研究Beclin-1在胃癌细胞自噬中的作用机制奠定了基础。     

miR-138-5p通过调控自噬影响乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性的体外研究

目的 探讨miR-138-5p对乳腺癌细胞他莫昔芬(TAM)耐药性的影响及其机制。方法 体外培养乳腺癌细胞MCF-7和TAM耐药细胞株MCF-7/TAM,设置正常对照组(MCF-7细胞)、耐药对照组(MCF-7/TAM细胞)、LV-NC组(MCF-7/TAM细胞+慢病毒空载体)和LV-miR-138-5p mimics组(MCF-7/TAM细胞+miR-138-5p mimics慢病毒)。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组细胞miR-138-5p表达水平;通过MTT法检测各组细胞增殖抑制率;通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率;通过MDC染色法检测各组细胞自噬小体数量;通过Western blot法检测各组细胞LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达水平。结果 与正常对照组相比较,耐药对照组、LV-NC组细胞miR-138-5p、增殖抑制率、凋亡率、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1表达水平及自噬小体数显著升高(P<0.05)。过表达miR-138-5p后,细胞增殖抑制率、凋亡率、蛋白Bcl-2表达水平显著升高...     

远志皂苷元对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察远志皂苷元(TEN)对阿尔茨海默病体外模型β-淀粉样蛋白1-42(Aβ_1-42)诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响。方法:体外培养PC12细胞,并随机分为对照组(正常生长PC12细胞)、模型组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤)以及TEN低、中、高剂量组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤+TEN低、中、高剂量)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白和自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果:与对照组比较,模型组细胞活力明显下降(P<0.01),p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01),Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,TEN各剂量组神经元存活率升高,p-...     

细胞内酸化对自噬的影响

目的探讨细胞内酸化对自噬的影响。方法利用pAd-miR-NHE-1病毒悬液转染人源性神经母细胞瘤细胞株,制备NHE-1基因敲低细胞模型。在透射电镜下观察阴性对照组及腺病毒转组转染成功后0.5、2、4、8 h自噬体的形成、线粒体形态及溶酶体数目的变化;Western blotting法检测自噬标记物LC3Ⅱ的表达。结果透射电镜下,阴性对照组线粒体形态及溶酶体数目正常,腺病毒转染成功后0.5～4 h可见线粒体肿胀、变形,溶酶体数目增多,自噬囊泡增多,自噬小体形成。8 h可见凋亡小体出现,线粒体数目减少,未见自噬小体,可见少量溶酶体。Western blotting显示,阴性对照组LC3Ⅱ表达较低,腺病毒转染成功后0.5 h LC3Ⅱ表达升高(P<0.01),4 h达高峰(P<0.01),8 h表达降低,且低于阴性对照组(P<0.01)。结论细胞内酸化可以激活自噬的发生。     

Pyr1-apelin-13对大鼠心肌成纤维细胞AMPK/mTOR自噬信号和氧化应激损伤的影响

目的探讨Pyr¹-apelin-13对于大鼠心肌成纤维细胞自噬和氧化应激的影响及其作用机制。方法提取新生大鼠心肌成纤维细胞(CFs),给与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),Pyr¹-apelin-13,雷帕霉素干预,使用Western blot法和免疫荧光技术检测自噬信号分子,使用DHE法检测氧自由基生成,观察Pyr¹-apelin-13在AMPK/mTOR通路中的作用。结果在体外培养的CFs细胞中,AngⅡ刺激通过上调P62和磷酸化mTOR抑制自噬水平,伴有LC3II、Beclin-1和磷酸化AMPK降低及氧化应激水平增高;而Pyr¹-apelin-13或雷帕霉素干预后逆转AngⅡ介导的自噬下调,表现为LC3II/I、Beclin-1和磷酸化AMPK水平上升,P62表达和磷酸化mTOR下降,细胞氧化应激损伤减轻。结论Pyr¹-apelin-13可通过调控大鼠心肌成纤维细胞AMPK/mTOR自噬信号发挥其抗氧化和促自噬的细胞保护功效。     

一种增强缺氧耐力的新大鼠模型

目的 探究一种新的快速提高缺氧耐力的大鼠模型.方法 采用小动物低压舱模拟不同的气压高度,观察SD大鼠4 500 m适应10 h,返回地面1 h,然后在7620 m停留24 h后的存活率;同时观察SD大鼠在禁食24 h、48 h和72 h后,在7620 m停留24 h后的存活率,并检测禁食72 h大鼠心肌的自噬通量.结果...     

Effects of small interfering RNA inhibit Class Ⅰ phosphoinositide 3-kinase on human gastric cancer cells

AIM:To investigate the effects of small interfering RNA(siRNA)-mediated inhibition of Class Ⅰ phosphoinositide 3-kinase(Class Ⅰ PI3K) signal transduction on the proliferation,apoptosis,and autophagy of gastric cancer SGC7901 and MGC803 cells.METHODS:We constructed the recombinant replication adenovirus PI3K(I)-RNA interference(RNAi)-green fluorescent protein(GFP) and control adenovirus NCRNAi-GFP,and infected it into human gastric cancer cells.MTT assay was used to determine the growth rate of the gastric cancer cells.Activation of autophagy was monitored with monodansylcadaverine(MDC) staining after adenovirus PI3K(I)-RNAi-GFP and control adenovirus NC-RNAi-GFP treatment.Immunofluorescence staining was used to detect the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3).Mitochondrial membrane potential was measured using the fluorescent probe JC-1.The expression of autophagy was monitored with MDC,LC3 staining,and transmission electron microscopy.Western blotting was used to detect p53,Beclin-1,Bcl-2,and LC3 protein expression in the culture supernatant.RESULTS:The viability of gastric cancer cells was inhibited after siRNA targeting to the Class Ⅰ PI3K blocked Class Ⅰ PI3K signal pathway.MTT assays revealed that,after SGC7901 cancer cells were treated with adenovirus PI3K(I)-RNAi-GFP,the rate of inhibition reached 27.48% ± 2.71% at 24 h,41.92% ± 2.02% at 48 h,and 50.85% ± 0.91% at 72 h.After MGC803 cancer cells were treated with adenovirus PI3K(I)-RNAiGFP,the rate of inhibition reached 24.39% ± 0.93% at 24 h,47.00% ± 0.87% at 48 h,and 70.30% ± 0.86% at 72 h(P < 0.05 compared to control group).It was determined that when 50 MOI,the transfection efficiency was 95% ± 2.4%.Adenovirus PI3K(I)RNAi-GFP(50 MOI) induced mitochondrial dysfunction and activated cell apoptosis in SGC7901 cells,and the results described here prove that RNAi of Class Ⅰ PI3K induced apoptosis in SGC7901 cells.The results showed that adenovirus PI3K(I)-RNAi-GFP transfection induced punctate distribution of     

红景天苷对高海拔缺氧条件下大鼠心肌自噬相关通路AMPK的影响

目的 探讨红景天苷保护高海拔缺氧损伤大鼠心脏的可能分子机制。方法 将40只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组（1 500 m）、缺氧生理盐水组（6 500 m+NS）、缺氧Compound C组（6 500 m+comC）、缺氧红景天苷组（6 500 m+Sal）、缺氧红景天苷+Compound C组（6 500 m+comC+Sal）。造模完成后进行血气分析、HE染色、荧光TUNEL检测及Western blot检测。结果 (1)缺氧后大鼠心肌结构发生变化,心肌凋亡加重（P<0.05）,红景天苷治疗可改善心肌细胞病理性损伤,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）;(2)缺氧后磷酸化AMPK水平上升,磷酸化mTOR水平降低（P<0.05）。而Compound C组AMPK及mTOR表现呈相反趋势,红景天苷治疗后AMPK及mTOR的表达水平介于Compound C组与红景天苷组之间,但是自噬蛋白Beclin-1的表达较Compound C组增加（P<0.05）。结论 红景天苷可以正向调节AMPK信号通路激活自噬,对缺氧损伤的大鼠心脏起保护作用。     

Nrf2/Sirt3信号通路在Irisin抵抗糖尿病心肌损伤中的作用

目的 明确鸢尾素（Irisin）在糖尿病心肌损伤中的作用及机制。方法 将小鼠以随机数字表法分为4组：NS组、Irisin组、糖尿病心肌病（DCM）组、DCM-Irisin干预组;体外实验分组：高糖高脂组（HG/HF）、HG/HFIrisin干预组、HG/HF-Irisin干预-Nrf2抑制剂组、HG/HF-Nrf2抑制剂组、HG/HF-Nrf2激动剂组、HG/HF-Nrf2激动剂-Sirt3抑制剂组、HG/HF-Irisin干预-Sirt3抑制剂组。采用Western blot、RT-PCR检测自噬及凋亡相关分子表达、CCK-8检测细胞活力、MMP和ATP检测评估线粒体功能、TUNEL染色检测细胞凋亡。结果 糖尿病小鼠心肌组织及高糖高脂诱导的H9c2细胞中Irisin的蛋白及mRNA表达量显著降低（P<0.05）,而LC3II/I和Cleaved caspase 3的表达量显著增加（P<0.01）,同时可见Nrf2及P62的蛋白表达量显著降低（P<0.01）。Irisin处理后,可部分缓解DCM导致的心肌细胞损伤。在给予Nrf2抑制剂ML385后,Irisin的保护作...     

支链氨基酸氨基转移酶1通过核因子E2相关因子2调节缺氧/复氧损伤相关的心肌细胞铁死亡

目的 研究支链氨基酸转移酶（branched-chain amino acid aminotransferase 1,BCAT1）调节心肌细胞铁死亡和缺氧/复氧损伤的作用及机制。方法 分离Sprague Dawley乳鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs）并培养。利用腺病毒载体转染NRVMs分别敲低或过表达BCAT1后给予NRVMs缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤或给予Erastin诱导其铁死亡。给予核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor-2,NRF2)特异性抑制剂ML385探讨NRF2在BCAT1调节NRVMs铁死亡中的作用。结果 敲低BCAT1表达加重H/R诱导的NRVMs死亡和脂质过氧化,而敲低BCAT1加重损伤的现象可被铁死亡抑制剂Ferr-1基本消除。过表达BCAT1可以减轻H/R和Erastin诱导的心肌细胞死亡和脂质过氧化。过表达BCAT1显著上调NRF2蛋白表达和下游抗氧化应激基因Ho-1、Nqo-1和Trx-1 ...     

过表达Fas激活的丝氨酸/苏氨酸激酶减轻缺氧/复氧损伤导致的心肌细胞线粒体呼吸功能障碍

目的 研究Fas激活的丝氨酸/苏氨酸激酶(Fas-activated serine/threonine kinase,FASTK)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤导致的心肌细胞线粒体呼吸功能障碍中的作用.方法 分离(1-2)d的野生C57BL/6小鼠原代心肌细胞并进行体外培养.转染...