三叶肽TFF1在大肠癌中的表达

目的 探讨三叶肽TFF1在大肠癌组织中的表达.方法 收集正常大肠组织及大肠腺瘤、腺瘤恶变、大肠癌组织标本,采用免疫组化S-P法检测TFF1因子,结合临床病理资料进行分析. 结果在正常大肠黏膜组织中TFF1无表达,而大肠癌组织中TFF1表达明显,且与正常大肠组织、大肠腺瘤、腺瘤恶变三者差异均有统计学意义(P<0.05),TFF1的表达水平与大肠癌分化程度、Dukes分期相关(P<0.05),与淋巴结转移不相关(P＞0.05). 结论在大肠腺瘤、大肠癌组织中TFF1的表达增高,提示TFF1在大肠癌的发生、发展中可能起着一定的作用.     

人肠三叶因子真核载体的构建与表达

目的 构建人肠三叶因子(hITF/hTFF3)的真核载体并在真核细胞中表达.方法 从人结肠粘膜提取总RNA,逆转录多聚酶反应制备总cDNA,PCR扩增hTFF3基因,TA克隆至pGEMT载体中,测序鉴定后将hTFF3基因重组到真核表达载体pCMV5-myc中,转染真核细胞293-T,裂解细胞后分别采用鼠抗人c-myc抗体和鼠抗人11下3抗体行Western-blot了解hTFF3表达情况.结果 从人结肠粘膜成功克隆了hTFF3基因并经测序验证,构建了pCMV5-myc-hTFF3真核表达载体,转染细胞后行western-blot提示hTFF3可在293-T细胞中表达.结论 成功构建pCMV5-myc-hTFF3重组真核载体并在293-T细胞中表达hTFF3蛋白,为进一步研究hTFF3的功能、作用机制及相互作用蛋白奠定了基础.     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建及稳定整合菌珠的筛选

目的 构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体，获得稳定整合酵母菌珠，为大量获得重组hITF、进行功能研究奠定基础。方法 通过PCR获得hITFcDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPICZαA分泌信号下游，得到重组载体pPICZαA—hITF，SαcⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33，Zeocin筛选转化酵母菌，PCR鉴定目的基因，MD、MM鉴定基因型。结果 经测序证实PCR扩增的hITFcDNA与基因文库中的完全一致并准确插入酵母表达载体pPICZαA中，氯化锂转化后，PCR鉴定证明重组载体整合进入酵母基因组中，基因型鉴定表明获得的酵母菌株均为Mut^＋。结论 成功构建出酵母表达载体pPICZαA—hITF，获得稳定整合hITFcDNA的酵母菌株，为hITF的大量表达及其功能研究奠定了基础。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性

目的:将改良LL-37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性. 方法:将编码改良的LL-37多肽的DNA序列放入载体pET-30a( ),转入工程菌BL21 star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL-37. 再以TALON柱芯亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱Macro-Prep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良LL-37的抗菌活性. 结果:改良的LL-37多肽于载体pET-30a( )在杆菌BL21 star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%. 融合蛋白经纯化后用SDS-PAGE鉴定在Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的LL-37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论:改良的人源性LL-37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.     

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达

应用DNA重组技术,将编码人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的基因插入到原核表达载体pET32M中,与载体中的硫氧还蛋白(相对分子质量约1.4万)基因融合。经双酶切鉴定、序列测定及工程菌初步表达分析,表明该重组质粒在大肠杆菌BL21中有明显表达。表达的硫氧还蛋白-VEGF融合蛋白的相对分子质量约为3.2万,主要以包涵体形式存在,也有少量重组蛋白为可溶性蛋白,Western印迹实验和生物活性分析证实可溶性的重组蛋白具有hVEGF的抗原性和促血管生长活性。     

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇ ＧＳＴ－ＦＧＦ。     

肠三叶因子在大鼠肠道中表达的实验研究

目的 研究肠三叶因子（ＩＴＦ）及其ｍＲＮＡ大鼠肠道的分布规律。方法 采用原位杂交、免疫组化等手段观察了ＩＴＦ及ＩＴＦｍＲＮＡ在大鼠肠道的表达并使用高效液相色谱仪检测了不同肠段ＩＴＦ的含量。结果 从十二指肠至结肠均有ＩＴＦ及ＩＴＦｍＲＮＡ表达，主要分布于肠绒毛杯状细胞，其中ＩＴＦｍＲＮＡ仅在杯状细胞的基底和边缘表达，其它区域的杯状细胞则呈ＩＴＦｍＲＮＡ阴性反应，同时发现部分其它部位的肠上皮细胞中亦有     

高密度培养大肠杆菌表达重组人胰高血糖素样肽-1

目的:高密度发酵培养表达重组人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1).方法:将构建的重组质粒pGEX-hGLP-1转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达hGLP-1的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pGEX-hGLP-1.在500 ml三角摇瓶中进行了诱导条件的摸索实验,之后用5 L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养,以获取hGLP-1和谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(GST-hGLP-1).结果:采用分批培养和补料分批培养相结合的技术,控制碳源和氮源的补加,控制溶解氧的量,可使重组工程菌发酵光密度D600值达52,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白量的28％,其含量达到2.1 g/L.用ESI质谱鉴定hGLP-1相对分子质量与理论值一致.结论:本研究为大规模生产重组hGLP-1奠定了基础.     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

肺腺癌患者血清TFF3的表达水平及其预后意义

目的 分析肺腺癌患者血清三叶因子3(TFF3)的表达水平,探讨其对肺腺癌预后评估的意义。方法 选取2015年1月至2018年12月于海安市中医院肿瘤科和呼吸科接受治疗的肺腺癌患者89例作为肺癌组,另选取同期体检合格者30例作为对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测两组研究对象血清TFF3水平;绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估TFF3对肺腺癌预后预测的价值;根据TFF3预测肺腺癌预后的截断值将患者分为TFF3高水平组48例（TFF3≥12.73 ng/mL）和TFF3低水平组41例（TFF3<12.73 ng/mL）。对肺腺癌组患者随访5～36个月采用Kaplan-Meier法进行生存分析,通过Log-rank法比较两组生存情况的差异。采用Cox多因素回归分析影响肺腺癌预后的危险因素。结果 肺癌组血清TFF3水平高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;TFF3预测术后肺腺癌患者死亡的最佳临界点为12.73 ng/mL,灵敏度81.2%,特异度64.3%,ROC曲线下面积（AUC）为0.794;Spearman相关分析显示,血清TFF3水平与肿瘤体积、淋巴结转移...     

N端延伸的人肠生长激素类似物基因的合成、克隆及融合表达

目的:合成、克隆及融合表达N端延伸2个Pro,并由Gly取代N端第2个氨基酸Ala的人肠生长激素类似物PP-h[Gly2]GLP-2,初步测定其促肠生长的生物学活性。方法:合成长度分别为53,54及53个碱基的三段寡核苷酸,以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR合成PP-h[Gly2]GLP-2基因,克隆于pUC18载体。经测序正确后,将该基因与融合表达载体pED连接构建融合表达质粒pEDGLP-2,转化E.coliBL21(DE3),进行诱导表达,用SDS-PAGE分析。融合蛋白经分离纯化和酸切割后,分离获得PP-h[Gly2]GLP-2,用电喷雾质谱法测定其相对分子质量,并对雄性SD大鼠皮下给药14 d,初步测定其促肠生长活性。结果:诱导后融合蛋白表达量占菌体可溶性总蛋白的40%以上。电喷雾质谱法测得:经酸切割获得的PP-h[Gly2]GLP-2的相对分子质量为3 947.97 Da,与预测值3 947.38 Da基本一致。初步动物实验结果显示,0.5 mg/(kg.d)剂量组小肠增重百分比为41.65%,与PBS组相比具有显著差异。结论:制备获得的人肠生长激素类似物PP-h[Gly2]GLP-2,与设计的相对分子质量一致,有明显的促肠生长活性。     

Expression and purification of recombinant human hemangiopoietin in Escherichia coli

Objective： To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 （DE3）. Methods： Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 （DE3） by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid （NTA） affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results： The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion： We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application     

安胃汤对CAG模型大鼠胃黏膜病理改变及TFF1mRNA表达的影响

目的 探讨安胃汤对实验性慢性萎缩性胃炎大鼠模型的TFF1mRNA表达的影响.方法 采用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)慢性萎缩性胃炎大鼠模型,48只清洁级健康雄性Wistar大鼠随机分为空白组、病理模型组、安胃汤组、胃复春对照组共4组.光学显微镜观察胃黏膜病理变化,实时定量PCR方法 观察安胃汤对实验性慢性萎缩性胃炎大鼠模型胃黏膜TFF1mRNA表达的影响.结果 安胃汤与胃复春均能改善胃黏膜的病理形态,但以安胃汤效果为佳.与病理模型组相比,安胃汤组和胃复春对照组均显著提高TFF1mRNA/β-actin相对表达量比值(0.86±0.13vs0.54 ±0.10 and 0.83±0.10vs0.54±0.10,P<0.01),安胃汤组优于胃复春对照组(0.86 ±0.13vs0.83±0.10,P<0.01).结论 安胃汤能够改善慢性萎缩性胃炎大鼠模型胃黏膜的病理形态,可能通过增加胃黏膜TFF1mRNA表达而起到治疗CAG作用.     

TFF1在肺癌中的表达及作用研究

目的 研究三叶因子1（TFF1）在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达、甲基化状态及其功能。方法 选取98 例非小细胞肺癌患者手术切除的肺癌组织,采用RT-PCR、MSP 检测TFF1 在肺癌组织中的表达与甲基化状态,分析其与患者临床特点的相关性,以及检测肺癌细胞株H23、H1299、L78、H446、H157 及95D 中TFF1 的表达和甲基化状态以及5-aza-2''-deoxycytidine（DAC）处理后细胞株中TFF1 表达的变化。TFF1 转染H23 细胞株,MTT 法及克隆形成实验检测其增殖能力和克隆能力的变化,细胞凋亡实验及Western blot 检测凋亡相关蛋白Caspase3 表达水平。结果 TFF1 在肺癌组织中的甲基化率为56.1%（55/98）。TFF1 甲基化与肺癌患者的TNM 分期和淋巴结转移显著相关（P＜0.001）。TFF1 在H23 和H157 中无表达,在H1299、H446 及95D 中表达较低,在L78 中表达较高。DAC 处理后,细胞株TFF1 表达的变化分别为表达恢复（H23、H157）,表达增强（H1299,H446,95D）和无明显改变（L78）。恢复表达TFF1 后,H23 细胞株的增殖及克隆形成能力明显减弱（P＜0.05）,细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3 活性片段的表达明显增加。结论 TFF1 在肺癌组织中的甲基化状态与肺癌的TNM 分期和转移密切相关。TFF1 在肺癌细胞中的表达受DNA 甲基化的调控。肺癌细胞株H23 中恢复表达TFF1 可以抑制其增殖和克隆能力,促进其凋亡。     

瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性

目的:为优化瑞替普酶(reteplase,r-PA)在大肠杆菌中的高效融合表达的条件,并提高其复性率。方法:通过改变诱导时间和温度、诱导剂浓度、培养基pH值及氨苄青霉素(Amp)浓度等条件,利用SDS-PAGE分析以上条件的改变对表达产物产量的影响。运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化和复性。结果与结论:LB培养基pH值为6,Amp浓度为100μg/mL,乳糖浓度为5 mmol/L的条件下39℃诱导4 h可获得高效表达的r-PA融合蛋白,其表达量占全菌蛋白的70%,其产物主要以包涵体形式存在。融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化复性,其复性率可达10%,比活为55.7 U/μL。     

融合蛋白人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原核细胞中的表达

目的：构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3, GPC3）重组原核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因产物,与pMD-18 simple T 载体进行连接构建出T克隆载体;从T载体上获取基因片段,并对pET-32a（＋）空载体进行双酶切,用T4连接酶连接,构建出pET-32a（＋）-GPC3原核表达载体;对构建好的载体再次测序,并进行诱导表达。结果 PCR产物长度为837 bp,即扩增的GPC3 C末端长度,与NCBI网站的相比较,序列完全一致,说明pET-32a （＋）载体中正确插入了目的片段,并且诱导表达出蛋白。结论成功构建了融合表达Pet-GPC3载体,蛋白诱导表达成功。     

IIAsPLA2、TFF3在胃癌及癌前病变中的表达及意义

目的探讨ⅡA分泌型磷脂酶A2（secretoryphospholipaseA2groupⅡA,ⅡAsPLA2）、三叶因子3（trefoilfactor3,TFF3）在胃癌及癌前病变中的表达及其意义。方法采用免疫组化法检测二者在90例胃癌、80例胃黏膜异型增生及30例正常胃黏膜组织中的表达。结果ⅡAsPLA2、TFF3在轻度、中度＋重度异型增生胃黏膜、早期胃癌、进展期胃癌各组中的表达均高于正常胃黏膜组,它们之间存在统计学意义（P〈0．05）。结论ⅡAsPLA2表达降低可能与胃癌的侵袭性以及转移间存在着某种相关性,其低表达是胃癌预后评估的一个潜在指标。TFF3可能是胃黏膜恶性变过程中的早期分子事件。在胃黏膜恶性变及其以后的恶性演进过程中起作用．对胃癌早期诊断、治疗以及预测胃癌发生癌周组织转移可能具有重要的提示作用,二者在胃癌的发生、发展及演变过程中起着协同的作用,并对胃癌的预后存在一定的指导作用。     

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。