DHBV DNA在鸭胰脾组织中原位杂交的研究

目的：对慢性DHBV感染鸭的肝、胰、脾组织DHBV DNA作对比研究。方法：采用原位杂交技术。结果：DHBV不仅可以感染鸭肝细胞,且可感染胰、脾组织,DHBV DNA阳性细胞的分布密度以肝组织最高,胰脾次之。结论：DHBV具有组织器官泛嗜性,但其在肝外组织中的复制似不及在肝细胞中活跃。     

复方药物ZL-1在鸭乙型肝炎病毒实验感染模型中抗病毒作用的研究

目的　研究中药复方ZL 1在鸭乙型肝炎病毒 (DHBV)持续性感染模型中抗嗜肝DNA病毒的作用。方法应用中药复方ZL 1治疗实验感染鸭 ,口服给药 ,剂量 5 0 0mg·kg-1·d-1,分 2次服用 ,连续 4周。采用斑点分子杂交和Southern印迹杂交检测治疗后感染鸭血清和肝脏中病毒的动态变化。同时以拉米夫定及安慰剂作为对照组。结果　复方药物ZL 1治疗后血清中DHBVDNA均数从 3 .6× 10 10 拷贝 /ml下降至 0 .9× 10 10 拷贝 /ml(P <0 .0 1) ,抑制病毒率为 75 % ,但尚不能清除病毒血症 ,肝组织中总DHBVDNA和DHBV超螺旋型DNA量无明显减少 ,停药观察 2周 ,病毒复制反弹不明显。拉米夫定治疗后可显著降低病毒血症 (P <0 .0 1) ,抑制病毒率达 99% ,同时肝组织中总DHBVDNA和DHBV超螺旋型DNA量减少 ,但停药观察 2周 ,病毒复制反弹明显。安慰剂组 (口服生理盐水 )治疗前后病毒水平的差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　复方药物ZL 1治疗4周可使感染鸭病毒血症降低 ,但不能清除病毒血症 ,肝脏中病毒复制水平也无显著下降     

乙型肝炎病毒在宿主内不受核苷类药物影响的机理探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒在宿主中不受药物影响而得以长期与宿主共存的机理。方法 以核苷类药物拉米夫定（3TC）和无环鸟苷（ACV）对鸭乙肝病毒（DHBV）感染一日龄广州麻鸭模型进行治疗，以斑点杂交法检测治疗前后和停药后鸭血清中鸭乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（DHBV－DNA）的变化，并取提鸭的肝，肾，脾，肺，心组织中的DNA，用聚合酶链反应（PCR）方法检测DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况。结果 以斑点杂交法检测鸭血清DHBV－DNA，3TC和ACV两个治疗组在治疗后5－10d内血清DHBV－DNA含量持续下降（与模型组比较均P＜0．05），但停药后有回升倾向；用PCR方法检测各组的肝，肾，脾，肺，心组织，显示治疗后DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况与模型组比无显著性差异（P＞0．05）。进一步比较了斑点杂交法和PCR法检测的结果，显示斑点杂交法检测组织中病毒远不如PCR法敏感，并提示可能组织中病毒复制量很低，以致用斑点杂交法检测出现很多假阴性。结论 乙型肝炎病毒感染宿主后，药物治疗只对宿主血清DHBV－DNA含量有影响，但未发现对肝和肝外脏器组织中DHBV－DNA有影响，乙肝病毒不受药物影响而长期在宿主中存在并低水平持续复制，可导致宿主机体对其无法识别和清除而形成慢性感染。建议使用较敏感的PCR法监控组织中DHBV－DNA含量，作为评价药物长期疗效的指标之一。     

鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测

目的 探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染麻鸭外周血中能否检测出DHBVcccDNA.方法 选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭24只随机分均分为4组,分别以(1)A组:D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100 μg/kg;(2)B组:D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;(3)C组:D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次;(4)NC组:生理盐水处理作为正常对照组(NC组).在处理后0、24、36和48 h进行血清ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA检测,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA.结果 NC组鸭肝脏无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组之间的肝损伤程度分级差异有统计学意义(P＜0.01).B组和C组在处理后48 h分别有1只和4只鸭死亡.NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在处理后36 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在(0.32～1.72)×104拷贝/ml之间,在处理后48 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA.Logistic逐步回归分析显示血清中DHBVcccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA 含量无关.结论 在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA,血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关.     

野水鸭等携带鸭乙型肝炎病毒的研究初报

本文应用斑点分子杂交（Dotblot）和斑点酶免疫测定法（DotEIA）对广州和海南地区3个鸭种携带鸭乙型肝炎病毒（DHBV）进行了调查，38只野水鸭血清标本DHBV自然感染率为63．2％（24／38）．其一日龄雏鸭DHBVDNA阳性率为80％（8／10）。在国内外未见类似报导。应用野水鸭阳性DHBVDNA血清以0．02～0．2ml／只量感染8只1日龄DHBVDNA阴性的广州麻鸭，获得100％感染，且病毒血症至少可持续60天，该野水鸭经鉴定为驯养的野生绿头鸭种，此将为DHBV基因分析比较与建立一种慢性感染的鸭乙肝实验模型提供良好的线索。     

经垂直传播自然感染DHBV幼鸭的肝组织病理学研究

本文选择血清DHBV阳性的雄鸭、雌鸭交配产卵,人工孵育的幼鸭经1年单独人工饲养后进行血清检测和肝活体组织检查。结果亲代双方均为带毒者经垂直传播子代的自然感染率高达45.5％。在10只血清DHBV阳性幼鸭中,全部肝组织均见点灶状坏死,而12只DHBV阴性幼鸭中仅3只肝组织可见坏死灶,两组相比差异有显著性。表明鸭肝组织病变与DHBV感染有十分密切的关系。     

阿的福韦在鸭乙型肝炎模型及2.2.15细胞中抗乙型肝炎病毒的药效研究

目的:观察阿的福韦体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用及体外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果.方法:采用鸭乙型肝炎动物模型,用阿的福韦口服治疗10天,检测用药前后血清中的DHBV DNA、DHBsAg,并取肝脏样本提取总DNA,作Southern Blot分析.此外,以2.2.15细胞为靶细胞,给药后通过检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA观察阿的福韦抗HBV效果.结果:阿的福韦各剂量组用药后均能使血清中的DHBVDNA显著降低或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01),但停药后有DHBV DNA回升现象;用药前后DHBsAg无明显改变.肝组织Southern Blot分析亦显示用药后肝脏中DHBV DNA有明显降低,停药后DHBV DNA反跳明显.大剂量阿的福韦加入细胞培养12天,对HBsAg抑制率为17.01%,对HBeAg抑制率为26.80%,对HBV DNA抑制率为26.92%.结论:阿的福韦在鸭体内有抗鸭乙型肝炎病毒的作用,但停药后DHBVDNA有"反跳"现象;体外实验无明显抗HBV病毒作用.     

DHBV肝内原位复制与致病性的关系研究

目的　建立DHBsAg免疫细胞化学检测方法 ,研究DHBV肝内原位复制与致病性的关系。方法　采集不同感染状态肝组织标本共 2 2份 ,分别进行DHBsAg免疫组化、Southernblot及组织病理学观察。结果　DHBsAg主要表达于肝细胞胞浆内 ,多呈弥漫性分布 ,无明显胞浆内包涵体形成。急性感染组病毒复制高峰期阳性细胞仅为 2 4 %～ 5 8% ,慢性感染组可 >95 % ;Southern杂交检测急性感染组DHBVDNA为 8.0 5± 2 .72 ,慢性感染组为 18.88± 3.86 (P <0 .0 5 )。不同感染组肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润均不明显 ,血清ALT、AST无显著变化。结论　DHBsAg免疫细胞化学方法的建立在细胞水平实现了对病毒表达抗原的定位观察。此外 ,嗜肝病毒的复制不是引起肝细胞损伤的直接原因。     

鸭乙型肝炎病毒感染特异细胞介导免疫检测方法的建立

目的：建立简便、特异的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染特异细胞介导免疫（CMI）检测方法。方法：分别从DHBV强阳性的血清和肝组织中纯化DHBsAg、DHBcAg,Bradford法定量后，用于急性DHBV感染重庆麻鸭CMI的检测。结果：急性感染后10d鸭外周血单个核细胞（PBMC）快速出现对DHBsAg、DHBcAg的不同程度增殖反应，5周内下降至正常水平。7份刺激细胞上清DuIFN-γ检测结果为阳性，OD540nm读数介于0．062－0．108之间，细胞因子的表达水平与PBMC增殖反应强度呈现较好的相关性。结论：DHBV感染重庆麻鸭CMI检测方法的建立，为了解感染鸭特异免疫应答状态提供了重要参考。     

鸭乙型肝炎动物模型的研究

本研究以双盲法进行家鸭的血清学和肝组织病理学检查。结果表明:(1)江苏麻鸭可能是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)最为易感的鸭种;(2)DHBV DNA与HBV DNA存在一定的同源性,且DHsAg与HBsAg也有部分交叉反应;(3)DHBV感染可造成鸭肝组织的急性或慢性肝炎病变;(4)DHBV感染可能主要在胚卵和雏鸭阶段。这些特点提示,研究人乙型肝炎有可能借助于鸭乙型肝炎动物模型。     

胎儿肝外组织乙型肝炎病毒感染

用敏感的分子杂交方法从2例HBV宫内感染胎儿的肝组织及脾脏、胰腺、肾脏和胎盘等多种肝外组织检测到HBV DHA,证实胚胎期亦存在肝外组织HBV感染。     

Ultrastructural study on extrahepatic infection of duck hepatitis B virus in ducks.

Kidney and pancreas tissues from congenitally infected Ma ducks with duck hepatitis B virus (DHBV) were examined by immunohistochemical staining technique and electron microscopy. The immunostaining showed that DHBV antigen was localized in the cytoplasm of tubular epithelial cells of kidney and acinar cells of pancreas of infected ducks. Under electron microscope, we found that complete and incomplete DHBV particles existed in the dilated cisternae of rough endoplasmic reticulum of both the cells. The size of complete and incomplete virus particles was nearly uniform in both the cells, 50-65 nm and 40-50 nm in diameter respectively. Therefore, extrahepatic infection and replication of DHBV were directly demonstrated ultrastructurally.

     

"911"抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究

目的：评价药物“911”在鸭实验动物模型中抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的效果。方法：北京鸭足静脉注射DHBV，第1次试验随机分为空白，Ara-AMP对照和20，40，80mg/kg3个治疗组，于感染后第7d,给药后第5，10d和停药后第5d采血，第2次试验设空白对照和40．80mg/kg2个治疗组，用药后第5，10d及停药后第5d各组分别处死3只鸭取肝脏检测肝HDBV DNA，采用DOT EIA法检测血清DHBsAg，斑点分子杂交法检测DHBV DNA，Southern转膜杂交检测鸭肝DHBV DNA。结果：第1次试验结果表明，血清DHBsAg及DHBV DNA在20mg/kg组基本无变化，在40mg/kg组治疗后明显下降，但效果无80mg/kg组明显；80mg/kg组DHBsAg 及DHBV DNA水平治疗效果最明显，与用药前及空白对照比较均有统计学意义。第2次试验与第1次试验的结果基本吻合，鸭肝脏DHBV DNA检测表明，80mg/kg治疗组对鸭肝DHBV DNA复制有明显抑制作用。可减少鸭肝DHBV DNA含量。结论：“911”有较好的抗DHBV感染效果，具有明显的剂量反应关系和可重复性。     

应用流式细胞仪判断正常及肝硬化过程脾脏对肝脏Kupffer,Ito和实质细胞DNA和RNA含量影响

由细胞培养和肝硬化模型获得经脾条件(液)处理的Kuppffer、Ito和肝实质细胞,应用流式细胞仪(FCM)测定三种细胞DNA与RNA的相对含量,经统计学处理不同组间的差异,以判断脾脏对正常肝脏是否具调控作用以及对肝硬化形成促进作用的具体环节。结果发现:①脾脏对Kupffer细胞在生理状态下促进增殖(DNA合成增加),限制Pr等物的产生(RNA转录减少);在肝硬化形成过程即促进增殖又促进其生物合成;②对Ito细胞生理状态下抑制增殖,促进生物合成;在肝硬化过程脾脏的调控方式未变,但作用力更强;③对肝实质细胞在生理状态下促进其增殖与生物合成,但在肝硬化形成过程脾脏对实质细胞本身未见明显影响。提示肝硬化过程脾脏影响Kupffer和Ito细胞的增殖与生物合成是脾脏促进肝硬化形成的主要方式。     

万乃洛韦抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目的 观察万乃洛韦在体内抗鸭乙型肝为病毒（DHBV）的作用,为临床治疗乙型肝炎病人提供实验依据。方法 采用重庆麻鸭乙型肝炎动物模型,用万乃洛韦治疗1个月,检测用药前后血清中的DHBV DNA及转氨酶、肝转氨酶、肝细胞病理、肝细胞中的DHBV DNA等。结果 万乃洛韦用药1月能使血清DHBV DNA总体水平显著降低（P＜0．05或P＜0．01）,各剂量组血清DHBV DNA有阴转现象。肝脏病理检查及血清转氨酶 检查发现,万乃洛韦对肝组织无明显影响,大剂量用药组ALT虽有轻度升高,但停药后即恢复正常。Southem Blot检测肝组织内DHBV DNA,提示该药能抑制病毒在肝内的复制,但不能彻底清除超螺旋DNA。结论 万乃洛韦在体内有抗鸭乙型肝炎病毒的作用。     

ITP患者自体脾移植再生脾免疫结构变化的临床研究

探讨原发性血小板减少性紫癜患者自体脾移植后再生脾的免疫结构变化及其对原发病的影响。方法：对１２例ＩＴＰ患者行脾切除自体脾移植术,术后６月活检再生脾组织,应用ＡＢＣ免疫组织化和图像分析,结合透射电镜对脾组织的形态结构,巨噬细胞和树突状细胞等主要免疫细胞成份进行观察。     

Experimental study on pathogenicity of precore mutants in Hepadnaviridae

OBJECTIVE: To study the replicative competency and pathogenicity of precore gene mutants of duck hepatitis B virus (DHBV) in the duck model. METHODS: Three site-directed point mutations in the precore region of cloned DHBV were constructed. Head-to-tail dimers were formed. The three plasmids were named: pEDM1-2 (initiation codon ATG mutated to TTG), pEDM2-2 (an "A" was inserted down stream of codon 12, leading to frame shift in the distal end of precore region), pEDM3-2 (codon 38 was changed from TAT to TAA, leading to a stop codon at the 3'-end). Mutants and wild-type cloned DNA dimers were first separately used to transfect LMH cells (a chicken hepatoma cell line) and viruses were collected from supernatant and used to infect 6 one-day-old ducklings per group. Serum duck hepatitis B surface antigen (DHBsAg) and DHBV DNA were assayed. Six weeks after infection, ducks were killed and liver tissues were studied for histopathological changes. RESULTS: After transfection, pEDM1-2, pEDM2-2 and pEDM3-2 expressed similar level of DHBsAg. Replication of pEDM1-2 and pEDM3-2 was similar to that of the wild type clone, while pEDM2-2 replicated at a significantly decreased level. Infection study employing the supernatant of transfected cells was as follows: pEDM1-2 infected 5/6 ducklings, pEDM2-2 non infected, pEDM3-2 infected 2/6 ducklings, wild type virus infected 6/6 ducklings. Positive serum samples from both pEDM1-2 and pEDM3-2 were at a lower serum DHBV level compared to that of the wild type virus. Pathological changes were more significant in pEDM3-2 infected duck livers, with numerous inflammatory cells in portal tract and infiltration into parenchyma. CONCLUSIONS: Mutations in the initiating codon or generation of a stop codon at the 3'-end of the precore region resulted in decreased replication competency of DHBV, while frame-shift mutation of the precore region, covering the epsilon encapsidation signal abolished the replication of DHBV. When the mutants replicated in hosts, more severe pathological changes were observed in ducks infected with mutant harboring a stop codon at the 3'-end. Data suggest that replicative-competent DHBV precore mutant can be more pathogenic than wild-type DHBV.     

Duck hepatitis B virus infection and duck hepatocellular carcinoma.

To study the relationship between duck hepatitis B virus (DHBV) infection and duck hepatocellular carcinoma (DHCC), histological examination and DHBV DNA hybridization were performed in 875 ducks from three flocks in Qidong County. Among them, 34 suffered from hepatoma, including 23 hepatocellular carcinoma, 8 cholangiocarcinoma and 3 hepatocellular-cholangiocarcinoma. Of the 34 ducks with hepatoma 27 were positive for DHBV DNA in the liver and/or serum. DHBV DNA was demonstrated in neoplastic nodules of 22 ducks. Southern blot analysis showed that 13 cases were of the integrated pattern of DHBV DNA in neoplastic nodules. The paratumor tissues of 14 ducks with massive tumor were analysed at the same time. Five cases showed integrated pattern, 4 cases free pattern and the other 4 cases both integration and free pattern of DHBV DNA. The hybridization pattern of DHBV DNA in tumor nodule was different from that in paratumor regions in 11 cases and identical in 3 cases. DHBV antigen was positive in 13 tumor nodules and 21 paratumor tissues in the 34 ducks with hepatic tumor by both victoria blue and orcein stain methods. Advanced liver diseases were found in 30 out of the 34 ducks with hepatoma, including 12 cirrhosis and 18 chronic active hepatitis. In southern blot analysis of 122 DHBV DNA positive Qidong ducks without hepatoma, only free pattern of DHBV was seen, while 44 control ducks from Changchun were negative for DHBV DNA. Neither hepatic tumor nor liver diseases were seen in the control ducks. The results suggest that hepatocellular carcinoma in ducks is similar to that in human HCC. They have a high frequency of viral DNA integrated into the host genome and a liver disease background.