细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究

目的分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率。方法用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质。结果表达产物分子质量单位约为37.5ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%。结论细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验

目的　用柔嫩艾美球虫 (Eimeriatenella ,E .t)子孢子表面蛋白基因构建的DNA重组质粒免疫海兰小公雏 ,观察其诱导鸡产生的免疫应答反应和对球虫攻击的保护作用。　方法　重组质粒经肌肉和鼻黏膜分别于 7、14、2 8日龄3次接种小公雏 ,用间接ELISA、流式细胞仪检测免疫反应。最后一次免疫后 2周经口接种新鲜的E .t孢子化卵囊 ,确定其保护力的大小。　结果　构建的柔嫩艾美球虫重组质粒免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫 ,表现为CD4+ /CD8+ T细胞比率、特异性抗体滴度明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。可对抗中等剂量球虫的攻击 ,试验组和对照组相比 ,攻虫后卵囊排出量显著减少 ,体重增长快 ,盲肠病变较小 ,保护率达 80 %以上。肌注 10 0 μg重组质粒组综合免疫保护效果最好。　结论　构建的重组质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

HBsAg真核表达质粒及其诱导的小鼠特异性免疫应答

目的 研究HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S在真核细胞中的表达和质粒DNA的免疫效果。方法 应用基因重组技术构建HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S；经酶切和测序鉴定无误后，用阳离子脂质体介导的方法将重组质粒转染HepG2和COS-7细胞，48h后，再ELISA的方法检测重组质粒在细胞中HBsAg的表达，同时同质粒DNA免疫小鼠，用ELISA检测免疫小鼠血清抗-HBs抗体水平；用乳酸脱氢酶释放法检测小鼠肿瘤细胞HBsAg特异性CTL反应。结果 重组质粒pCI-S和pcDNA3.1-S转染的HepG2和COS-7细胞培养上清液和sAg均为阳性。DNA免疫小鼠血清可检测到高滴度的抗-HBs抗体，免疫小鼠脾细胞可检测到校强的HBsAg特异性CTL反应。结论 HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S可在HepG2和COS-7细胞中高效表达，DNA免疫小鼠成功地诱导出抗-HBs和HBsAg特异性CTL反应。     

布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立

目的为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建。方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E. coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集。结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌。结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景。     

幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmMDNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性。方法RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体。测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认。通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性。结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的HpglmM序列有96%的同源性。PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1。重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符。ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上。结论成功构建了pVAX1-glmMDNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA_3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答

目的　探讨恶性疟原虫ＤＮＡ 疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法　将恶性疟原虫ＦＣＣ－ １／ＨＮ株有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌途径注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,对注射部位的骨骼肌进行了预处理,即于注射前７ｄ 先在左后肢股四头肌注射０．５％ 盐酸布比卡因５０μｌ,注射深度为２ｍ ｍ 。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ４＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值和ＮＫ 细胞杀伤活性的变化。结果　１）重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经肌肉注射途径免疫小鼠后,机体ＩｇＧ抗体滴度增高、特异性Ｔ淋巴细胞增殖反应增强、ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值增高以及ＮＫ细胞杀伤活性增强。２）肌肉注射为一有效的ＤＮＡ疫苗免疫途径。结论　采用编码有性期基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌注射途径免疫小鼠,能诱导机体有效的体液免疫、细胞免疫和ＮＫ细胞杀伤活性。本研究为恶性疟ＤＮＡ疫苗的研究提供了免疫学实验依据     

重组血吸虫GST-Sj31蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫组织蛋白酶B（Sj31）b、c片段蛋白，并对表达产物进行免疫保护效果测定。方法 分别将重组质粒pGEX-Sj31b、pGEX-Sj31c转化感受态大肠杆菌ER2566，在IPTG诱导下进行表达，表达产物GST-Sj31b、GST-Sj31c蛋白分别免疫小鼠，免疫第3次后进行攻击感染，观察其免疫保护效果。结果 在IPTG诱导下，表达载体中的SjGST基因与重组Sj31b和Sj31c基因获得了高产融合表达，用这两种融合蛋白免疫小鼠，分别诱导产生了22.71%和13.6%的减虫率；减卵率分别为54.21%和45.01%。结论 重组质粒pGEX-Sj31b，pGEX-Sj31c可在大肠杆菌中高效表达，表达的融合蛋白GST-Sj31b能诱导小鼠产生一定程度的抗Sj保护性免疫力，而GST-Sj31c的减虫率为13.6%。     

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。     

MAGE-3目的基因真核表达载体的构建

目的构建黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）目的基因真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3.方法用RT-PCR法从肝癌组织制备含BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pcDNA3.1载体上,根据氨苄青霉素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、引物扩增等方法筛选、鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列MAGE-3目的基因进行DNA测序.结果扩增出MAGE-3目的基因;重组质粒pcDNA3.1-MAGE-3中的插入片段经DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较,结果完全一致.结论成功构建了真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3,为肿瘤免疫治疗提供了条件.     

布鲁氏菌自杀载体的改建及其在突变株构建中的应用

目的:改建布鲁氏菌自杀载体.方法:用NdeⅠ将pKOBEG-SacB质粒中的反向筛选基因SacB切下来,与同样酶切处理的pUC19质粒连接,得到pUC19-SacB,经测序和蔗糖筛选实验证实.结果:成功将SacB从pKOBEG-SacB中切下来并插入到pUC19质粒中,构建得到了pUC19- SacB.测序和蔗糖筛选实验证实.插入的sacB基因具有较好的反筛功能.我们利用该质粒,成功的构建了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的突变株,改建的载体能高效的应用于布鲁氏菌染色体的精确修饰.结论:构建了一个新的自杀质粒pUC19-SacB,该质粒能用于布鲁氏菌无痕缺失突变株的构建.     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达

目的　构建日本血吸虫 14kDa脂肪酸结合蛋白 (Sj14FABP)和细胞因子IL 12共表达质粒 ,并观察其能否在小鼠体内获得表达。方法　TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA ,采用RT PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列 ,经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2 IL12中 ,通过PCR、酶切及测序进行鉴定。大量制备重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠 ,取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验。结果　RT PCR扩增出一条大小为 4 4 0bp的片段 ;经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因 ;间接免疫荧光试验结果为阳性。 结论　本试验成功构建重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP ,并在小鼠体内获得表达。     

9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。     

真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α的构建与鉴定

目的 构建重组人缺氧诱导因子-lα（HIF-lα）真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α,为进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定基础。方法 从人血细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板筛选菌落,提取质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果 获得重组质粒pcDNA4/rhHIF-1α,经PCR扩增获得的目的基因相对分子质量与预计相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论 重组的人HIF-lα真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α构建成功,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,可用于人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体制备的研究。     

不同片段的NPM1-EGFP融合表达载体的构建和表达

目的构建不同片段的NPM1与绿色荧光蛋白(EGFP)的真核融合表达质粒,检测其在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达和定位。方法 RT-PCR法从人乳腺癌MDA-MB-231细胞cDNA中扩增不同片段的NPM1,产物经电泳分离、切胶纯化后,分别采用XhoⅠ和EcoRⅠ进行酶切,然后与同样酶切后的pEGFP-C3载体进行连接反应,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,挑取克隆,提取质粒并酶切鉴定。将酶切及测序鉴定后的pEGFP/NPM1质粒采用脂质体介导后将其转入MDA-MB-231细胞中,通过Western blot技术检测其蛋白的表达。倒置荧光显微镜观察其亚细胞定位。结果酶切鉴定和基因测序结果显示不同片段的pEGFP-NPM1融合表达质粒构建成功,并可在MDA-MB-231细胞内表达,倒置荧光显微镜下可以清晰显见融合蛋白的亚细胞定位。结论 NPM1及其不同结构域的真核重组质粒构建成功,在细胞中成功表达,并可以用于分析其亚细胞定位,从而为进一步研究NPM1在乳腺癌发生发展中的作用奠定基础。     

白念珠菌mp65基因真核质粒的构建及免疫原性研究

目的构建以白念珠菌甘露糖蛋白65(MP65)编码基因mp65为目的基因真核重组表达质粒,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株ATCC64550中获取mp65基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1中,将真核表达经质粒大抽提并定量后免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体产生水平,流式检测细胞免疫。结果PCR法克隆出全长为1140bp的mp65基因,构建出pcDNA3.1-mp65真核表达质粒,pcDNA3.1-mp65免疫小鼠能诱导产生效价为1∶800的IgG抗体,同时诱导CD4+T和CD8+T细胞百分含量增高。结论白念珠菌真核表达质粒pcDNA3.1-mp65成功构建并能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫。