VEGF高表达的胶质瘤细胞C6对共培养微血管内皮细胞表达Flk-1及Flt-1的影响

目的:以正常鼠肝细胞系BRL 3A为对照,研究VEGF高表达的恶性胶质瘤细胞系C6对体外共培养的肺微血管内皮细胞表达Flt-1、Flk-1的影响。方法:建立体外C6,BRL 3A与肺微血管内皮细胞的共培养方法,利用免疫细胞化学方法检测共培养后的微血管内皮细胞上VEGF受体Flt-1、Flk-1蛋白的表达变化,进一步采用RT-PCR和Northernblot分析Flt-1、Flk-1mRNA表达的改变。结果:与胶质瘤细胞C6共培养的微血管内皮细胞Flk-1、Flt-1蛋白表达增加 (P <0.05),而与BRL 3A共培养的内皮细胞Flk-1、Flt-1蛋白表达下降 (P <0.01),RT-PCR和Northernblot检测发现与C6共培养后可上调微血管内皮细胞Flk-1、Flt-1mRNA的表达 (P <0.01),而与BRL 3A共培养下调了Flk-1、Flt-1mRNA的表达 (P <0.01)。结论:VEGF高表达的胶质瘤细胞C6对共培养的微血管内皮细胞表达Flk-1、Flt-1有明显的上调作用,这可能是体内胶质瘤血管新生的重要机制之一.     

转录因子Bach1对人微血管内皮细胞的作用研究

 目的:研究转录因子Bach1对人微血管内皮细胞功能的影响。方法: 利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）细胞转染技术下调内皮细胞Bach1表达;用Matrigel管腔形成实验检测内皮细胞体外血管新生的能力;用Transwell小室法检测细胞迁移;用CCK-8法测定细胞增殖;用实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA法检测细胞中血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）mRNA 和蛋白的表达情况;用转染报告基因的方法检测VEGF基因的转录活性。结果: 下调内皮细胞Bach1表达明显促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成能力,对内皮细胞增殖能力无明显影响;抑制Bach1表达促进内皮细胞HO-1 mRNA 和蛋白的表达,增加VEGF 转录活性及mRNA和蛋白的表达。结论: 抑制转录因子Bach1表达可增加内皮细胞HO-1和VEGF的表达,促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成,提示Bach1是负性调控血管新生的因子。     

胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学观察

目的 探讨胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学特征。方法 利用电镜技术观察血管内皮细胞Ecv304和C6胶质瘤细胞共培养(混合共培养、Transwell共培养、Transwell膜两面共培养)后的内皮细胞的孔窗、内皮细胞之间的连接及内皮细胞与肿瘤细胞的相互关系、瘤细胞的“血管周足”等的形态学特征；并与4例人脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障进行比较。结果 电镜下发现ECV304细胞经与C6细胞按3种不同方式共培养汇合后均为无孔窗型内皮细胞，细胞间出现紧密连接；Transwell共培养的膜上C6细胞未见伸出伪足突向膜的微孔；经膜两面共培养的瘤细胞则可通过Transwell的微孔突向内皮细胞侧，但瘤细胞未伸出伪足包绕内皮细胞或突入内皮细胞间隙，瘤细胞的“血管周足”不完整，后两者与脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障的形态特征相类似。结论 在体外经Transwell膜两面共培养的ECV304和C6胶质瘤细胞的系统可在一定程度模拟体内的血瘤屏障的形态学特征。     

抗人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体的生物学活性研究

目的研究抗KDR单体Ycom1D3抑制VEGF诱导脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的体外生物学活性。方法采用FACS鉴定Ycom1D3与抗原结合特异性，采用免疫共沉淀测定Ycom1D3阻断VEGF165刺激KDR酪氨酸激酶受体磷酸化作用，并采用[^3H]-Thymidine掺入法、内皮细胞损伤愈合试验和内皮细胞血管腔形成实验进一步确定Ycom1D3抑制VEGF165诱导内皮细胞增殖的中和活性。结果Ycom1D3不但能与HUVEC结合，而且能阻断由VEGF165刺激HUVEC表面KDR酪氨酸激酶受体磷酸化，进而显著抑制VEGF165诱导HUVEC增殖、迁移及体外三维胶原模型上内皮细胞毛细血管样结构的形成。结论Ycom1D3可以通过封闭KDR而抑制VEGF活性，在肿瘤及其它血管新生疾病治疗中具有潜在应用前景。     

缓激肽对胶质瘤血瘤屏障体外模型中钙激活钾电流的作用

目的建立胶质瘤血瘤屏障体外模型,研究缓激肽(BK)对胶质瘤血瘤屏障钙激活钾电流(Ikca)的作用,探讨BK开通血瘤屏障的机制。方法条件培养和共培养,膜片钳全细胞记录。结果条件培养的脑微血管内皮细胞(BMECs)形态无明显变化,胶质瘤C6细胞之间相互接触紧密。共培养的BMECs和C6细胞各自聚集,之间形成界面,1μmol.L-1缓激肽使BMECs和C6细胞界面内钙激活钾电流下降。结论1μmol.L-1的缓激肽抑制部分血瘤屏障体外模型BMECs和C6细胞的钙激活钾电流。     

鼠神经干细胞对胶质瘤C6细胞侵袭能力的影响

目的探讨鼠神经干细胞对鼠胶质瘤C6细胞侵袭能力的影响及机制。方法取新生1～2天SD大鼠大脑皮层组织,于无血清培养基中分离培养神经干细胞并进行NES免疫细胞化学染色,并将神经干细胞和鼠胶质瘤C6细胞于体外共培养,利用2D、3D生长实验和Transwell实验分别检测与鼠神经干细胞共培养鼠胶质瘤C6细胞(实验组)和单独培养鼠胶质瘤C6细胞(对照组)的侵袭能力。结果 2D实验中C6细胞的对照组和实验组的平均直径分别为(18.53±1.32)μm和(13.44±1.45)μm,差异有统计学意义(P<0.01)。3D实验中C6细胞的对照组和实验组的平均直径分别为(20.34±1.25)μm和(15.52±1.43)μm,差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell侵袭实验发现胶质瘤C6细胞组中对照组和实验组平均视野侵袭细胞为(36.45±1.36)个和(22.73±1.66)个,差异有统计学意义(P<0.01)。结论与神经干细胞共同培养后C6细胞的侵袭能力明显降低。     

肝癌肿瘤微环境对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响

研究间接共培养条件下肝癌细胞培养基对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响,初步探讨肿瘤微环境下血管新生的分子机制。体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,与肝癌细胞株HepG2条件培养基进行共培养;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测肝癌细胞条件培养基对血管内皮细胞增殖的影响;血管管腔形成实验检测血管内皮细胞的血管生成能力。Western blot测定肝癌细胞条件培养基对血管内皮EA.hy926细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1表达的影响。结果表明,EA.hy926细胞经HepG2条件培养基处理后,其增殖能力明显增加。接种于Matrigel胶的EA.hy926细胞经HepG2条件培养基刺激后,形成管腔数目增加,成血管能力明显增强;同时,其胞内VEGF及其受体Flk-1的表达呈时间依赖性上调。肿瘤微环境下肝癌细胞作用于血管内皮细胞,可促进血管内皮细胞的增殖并提高其血管生成能力。     

细胞共培养技术促进类前微血管结构发生

背景：三维(3D)组织化培养模型的体外构建是现代组织工程与再生医学工程技术的重要核心。如何实现所培养模型的微血管化以改善培养体系内部的营养传递并最终提高细胞的活性是组织工程研究领域所亟待解决的关键。 目的：尝试探索在3D体系内采用细胞共培养技术促进类前微血管结构发生的可行性。 方法：以蚕丝蛋白为多孔材料支架,将人骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞进行体外共培养。通过DNA含量测定定量检测细胞的增殖;扫描电镜和激光共聚焦显微镜的图像分析表征细胞的生长形态学特征;实时定量RT-PCR方法对内皮细胞功能性标志基因的表达水平进行定量分析。 结果与结论：丝蛋白支架和人骨髓间充质干细胞能够提供理想的3D生长微环境,利于血管内皮细胞的体外增殖。微环境还能够显著提高内皮细胞功能性标志基因CD31和vWF的表达水平,促进类前微血管结构的发生。提示共培养体系有利于内皮细胞在体外的进一步分化和自组织化,可能为微血管化组织工程研究提供一定的技术基础。     

人脐血源性内皮祖细胞血管发生活性及其参与人恶性胶质瘤细胞异种移植瘤血管新生的作用

目的 观察人脐血源性内皮祖细胞(EPC)血管发生能力和在恶性胶质瘤血管新生过程中的作用.方法 应用密度梯度离心法分离新鲜人脐血的单个核细胞,接种于EGM-2培养液中培养获得EPC.取生长到第7～10天的细胞进行CD34和VEGFR-2免疫荧光双标染色.检测血管内皮生长因子(VEGF)刺激下EPC增殖活性、迁移能力和体外形成小管样结构的能力.采用人恶性胶质瘤细胞系U87在免疫缺陷小鼠进行皮下移植,于接种肿瘤后第7天经尾静脉注射EPC(每只5×103),并于接种肿瘤后第28天取材检测肿瘤微血管和EPC组织分布及定位,采用抗人CD31和抗鼠CD31免疫荧光双标记肿瘤微血管,计算人源性EPC来源的血管占肿瘤血管网的比例.结果 培养的细胞在第7～10天时可见条索样结构,生长并逐渐融合形成铺路石样排列的单层细胞,表达内皮细胞标记物CD34和VEGFR-2.在VEGF刺激下EPC具有较强的增殖活性、迁移能力和体外形成小管样结构的能力.外源性EPC能特异性归巢到异种移植瘤组织并形成新生血管,占肿瘤血管网的(18.68±1.32)%.结论 EPC在体内外具有形成血管能力,并参与异种移植瘤血管新生,提示其在恶性肿瘤血管新生过程中具有重要作用,并可能参与肿瘤微血管构筑表型异质性.     

HSF1基因缺失通过上调microRNA-195a-3p加速压力超负荷下心脏重构

目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)调控微小RNA-195a-3p (miR-195a-3p)对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响,旨在阐明HSF1基因缺失加重压力超负荷下心脏重构的病理分子机制。方法:压力超负荷动物模型采用小鼠主动脉弓缩窄(TAC),辅以心脏超声功能评价。在体实验分组为HSF1基因敲除(HSF1~(-/-))小鼠假手术组、C57BL/6野生型(WT)小鼠假手术组、HSF1~(-/-)小鼠TAC模型组和C57BL/6 WT小鼠TAC组;细胞实验分组为对照组、miR-195a-3p模拟物干预组和阴性对照microRNA(miR-NC)干预组。TAC术后4周,通过病理组织切片检测各组小鼠心肌肥厚(HE染色)和血管新生(CD31染色),小鼠心超检查心脏主要功能指标变化;通过生物信息软件TargetScan 6.2结合萤光素酶(luciferase)报告基因检测,以及Western blot验证,测定miR-195a-3p调控血管新生的下游分子靶点;并用miR-195a-3p诱导微血管内皮细胞,观察其对细胞成管能力的影响。结果:HSF1缺失会导致TAC诱导的小鼠左心室重构加重。芯片筛查结果表明HSF1缺失可促进心脏12种microRNAs表达上调,5种microRNAs在心肌微血管内皮细胞中表达显著升高,其中miR-195a-3p的增高具有统计学显著性。miR-195a-3p过表达可以有效抑制微血管内皮细胞CD31和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,阻滞细胞形成管腔样结构。TargetScan 6.2预测miR-195a-3p的靶点为AMP活化蛋白激酶α2(AMPKα2),在微血管内皮细胞用miR-195a-3p模拟物干预可以有效抑制AMPKα2的表达,同时miR-195a-3p模拟物也抑制了CD31和VEGF的表达。结论:HSF1基因缺失导致的miR-195a-3p表达上调是加速压力超负荷下心脏重构的重要诱因,其机制可能是通过抑制AMPKα2介导的血管新生信号通路的激活。     

缺氧微环境对胶质瘤细胞U251迁移性的影响

目的：探讨二氯化钴模拟化学缺氧的细胞微环境对人胶质瘤U251细胞增殖与迁移性的影响及其机制。方法胶质瘤U251细胞的培养基中加入二氯化钴模拟细胞缺氧,通过MTS检测细胞增殖,通过划痕实验检测细胞迁移,通过实时荧光定量PCR检测U251细胞表达血管内皮生长因子水平,采用免疫印迹检测细胞内缺氧诱导因子HIF-1α、动力蛋白RhoA与Cdc42、粘附分子E-cadherin与β-catenin表达,以及该过程中信号转导因子STAT3的磷酸化水平。结果二氯化钴不会促进U251细胞增殖,能显著促进细胞迁移;缺氧条件下U251细胞内VEGF水平升高, E-cadherin、β-catenin表达降低, HIF-1α表达和STAT3磷酸化水平随时间上调。结论二氯化钴模拟缺氧微环境可通过抑制U251细胞间粘附分子E-cadherin、β-catenin表达和提高VEGF-a水平,促进胶质瘤细胞迁移及周围血管生成,增强胶质瘤迁移与转移能力,细胞内信号转导分子HIF-1α和STAT3的激活在该过程中起重要作用。     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

Analysis of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and a receptor subtype (KDR/flk-1) in the liver of rats exposed to riddelliine: a potential role in the development of hemangiosarcoma

Riddelliine alters hepatocellular and endothelial cell kinetics and function including stimulating an increase in hepatocytic vascular endothelial growth factor (VEGF) in the absence of increased serological levels of VEGF (Nyska etal. 2002). The objective of this study was to further assess hepatic VEGF and KDR/flk-1 synthesis and expression by hepatic cells under riddelliine treatment conditions. Forty-two male F344/N rats were dosed by gavage with riddelliine (0, 1.0, and 2.5 mg/kg/day) for 6 weeks. Seven animals/group were sacrificed after 8 consecutive daily doses; remaining rats were terminated after 30 daily doses, excluding weekends. Hepatic tissues were evaluated by immunohistochemistry and in situ hybridization. The results showed that VEGF mRNA expression was observed in control and treated animals; however, qualitative differences were noted. Treated animals exhibited VEGF mRNA in clustered, focal hepatocytes and bile duct epithelium, whereas VEGF mRNA in hepatocytes from vehicle control rats was distributed evenly across all hepatocytes. Results evaluating the distribution of the VEGF cognate receptor, KDR/flk-1 showed that randomly distributed, rare sinusoidal endothelium, including those demonstrating karyomegaly and cytomegaly expressed KDR/flk-1. Phosphorylation of KDR/flk-1 at pTyr996 and pTyr1054/1059, but not pTyr951, was also detected, evidence that endothelial cell KDR/flk-1 was activated. These results suggest that both hepatocytes and endothelial cells are targets of riddelliine-induced injury. We speculate that damage to both populations of cells may lead to dysregulated VEGF synthesis by hepatocytes and activation of KDR/flk-1 by endothelium leading to the induction of sustained endothelial cell proliferation, culminating in the development of hepatic hemangiosarcoma.     

Expression and functional significance of vascular endothelial growth factor receptors in human tumor cells

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is one of the key factors in tumor neoangiogenesis, acting through its receptors KDR (VEGFR-2) and fit-1 (VEGFR-1) expressed on endothelial cells. Our data demonstrate that VEGFR-1 and to a lesser extent VEGFR-2 are expressed in a number of human tumor tissues and derived cells in culture. VEGFR-1 protein is expressed in 26 of 42 glioma tissues, 22 of which show a coexpression of VEGFR-1 with VEGFR-2; 1 glioma tissue expresses exclusively VEGFR-2. In the derived glioma cell cultures, we found VEGFR-1 mRNA expression in 6 of 11 cultures, with one coexpressing VEGFR-1 and VEGFR-2. Of four established glioma cell lines, two expressed VEGFR-1. In addition VEGFR-1 protein expression was demonstrated in 30 of 37 tumor tissues of squamous cell carcinomas of the head and neck, with VEGFR-2 coexpression in 15 tissues and an expression of VEGFR-2 alone in 1 tissue. Derived tumor cell cultures showed mRNA expression of VEGFR-1 alone in seven of seven cases. Established melanoma cell lines expressed VEGFR-1 mRNA in four of five lines, with VEGFR-2 coexpression in two lines. Concerning the functional significance of VEGF receptor expression, VEGF treatment of VEGFR-1-expressing tumor cells induced the inhibition of cell proliferation by 25 to 55% and the inhibition of tumor cell migration by 29 to 55%. Thus our data indicate that the coexpression of VEGF and VEGFR-1 in tumor cells could have an inhibitory effect on tumor cell proliferation and migration, a mechanism possibly induced as a response to a deficiency in nutrient and oxygen supply.     

Human Herpesvirus-8-Transformed Endothelial Cells Have Functionally Activated Vascular Endothelial Growth Factor/Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

Kaposi's sarcoma is a vascular tumor commonly associated with human immunodeficiency virus (HIV)-1 and human herpesvirus (HHV-8) also known as Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. The principal features of this tumor are abnormal proliferation of vascular structures lined with spindle-shaped endothelial cells. HHV-8 may transform a subpopulation of endothelial cells in vitro via viral and cellular gene expression. We hypothesized that among the cellular genes, vascular endothelial growth factors (VEGFs) and their cognate receptors may be involved in viral-mediated transformation. We have shown that HHV-8-transformed endothelial cells (EC-HHV-8) express higher levels of VEGF, VEGF-C, VEGF-D, and PlGF in addition to VEGF receptors-1, -2, and -3. Furthermore, antibodies to VEGF receptor-2 inhibited cell proliferation and viability. Similarly, inhibition of VEGF gene expression with antisense oligonucleotides inhibited EC-HHV-8 cell proliferation/viability. The growth and viability of primary endothelial cells and a fibroblast cell line however were unaffected by either the VEGF receptor-2 antibody or the VEGF antisense oligodeoxynucleotides. VEGF and VEGF receptors are thus induced in EC-HHV-8 and participate in the transformation. Inhibitors of VEGF may thus modulate the disease process during development and progression.     

血管内皮生长因子-C促进淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和F-肌动蛋白重组

目的 研究血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对于淋巴管内皮细胞增殖和迁移的作用，探讨VEGF-C促进淋巴管新生的机制。方法 从狗的胸导管分离和培养淋巴管内皮细胞。标记内皮细胞的VEGFR-3和F-肌动蛋白，在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下观察。用VEGF-C刺激后，计数增殖细胞和迁移细胞，测量细胞迁移距离，并与bFGF和VEGF的作用进行比较。结果 淋巴管内皮细胞表达VEGFR-3，静脉内皮细胞为阴性。bFGF和VEGF-C促进淋巴管内皮细胞的增殖，VEGF-C的作用比bFGF强。与对照组相比，bFGF、VEGF和VEGF-C组引起迁移细胞的数目增多和迁移距离增大，VEGF-C的作用最强。在VEGF-C组的迁移细胞，F-肌动蛋白和应力纤维明显增多。结论 淋巴管内皮细胞特异性表达VEGFR-3，VEGF-C促进淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，引起F-肌动蛋白的重组和应力纤维形成。     

小柴胡汤对C6 胶质瘤抑瘤作用的实验研究

目的:探讨不同剂量小柴胡汤对体外培养的C6 胶质瘤细胞的抑瘤作用及其作用机理。方法:将C6 胶质瘤细胞分别接种于96 孔、24 孔及6 孔培养板中,每种培养板均分为4 组:对照组、小柴胡汤低剂量组、中剂量组和高剂量组,待细胞铺满培养板底80% ~90%,开始加药,培养24 小时后终止培养。采用CCK-8、活体染色、ELISA、免疫细胞化学及流式细胞仪检测细胞增殖活性、细胞存活率、ESM-1 和VEGF 的蛋白含量及蛋白阳性表达强度和细胞的早期、晚期凋亡状况。结果:CCK-8 法检测显示小柴胡汤低、中、高剂量组对C6 胶质瘤细胞的生长均有抑制作用; ELISA 和免疫细胞化学法显示,小柴胡汤低、中、高剂量组均能降低ESM鄄1 和VEGF 的蛋白阳性表达强度及蛋白含量水平;流式细胞仪检测显示小柴胡汤低、中、高剂量组均能促进细胞凋亡;倒置显微镜观察可见随剂量增加细胞排列逐渐松散、萎缩,细胞漂浮死亡数量增多;各种检测法均显示随剂量增加抑制作用增强且具有剂量依赖性,组间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:小柴胡汤对C6 胶质瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,它可能通过下调ESM-1 和VEGF 蛋白水平、促进细胞凋亡,从而发挥抑瘤作用。     

柴胡皂苷D通过下调miR-517a调节胶质瘤细胞体外和体内移植瘤生长

目的探究柴胡皂苷D通过调控miR-517a对胶质瘤细胞体外和体内移植瘤生长的影响.方法采用MTT试剂盒检测U-87细胞和正常星形细胞的存活率;Q-PCR检测miR-517a表达;流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;CCK-8试剂盒检测细胞增殖;蛋白免疫印迹试剂盒检测cleaved caspase-3、Ki67、MMP-2、Cyclin D1蛋白水平.建立裸鼠移植瘤模型,检测各组肿瘤重量;免疫组化检测Ki67、VEGF表达.结果柴胡皂苷D对正常星形细胞存活率无影响,降低U-87细胞存活率,下调miR-517a表达,促进细胞凋亡,上调cleaved caspase-3蛋白表达,抑制细胞迁移、侵袭、增殖,下调MMP-2、Cyclin D1、Ki67蛋白表达;抑制体内移植瘤生长,降低Ki67、VEGF阳性表达率.结论柴胡皂苷D具有下调miR-517a调节胶质瘤细胞体外和体内移植瘤生长的作用.