多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因：102 CFU/mL,ace基因和zot基因：10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株（57.2%）携带ctxA毒素基因、31株（44.3%）携带ace毒素基因、46株（65.7%）携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。     

建立双重荧光定量PCR方法检测蜱传疏螺旋体

目的 建立双重荧光定量PCR方法,同时检测Borrelia burgdorferi和Borrelia miyamotoi。方法 分别利用recA基因、glpQ基因合成引物探针,并优化反应条件。在单重实验的基础上建立双重荧光定量PCR方法,对该方法灵敏度和特异度进行检测,并探索其他因素对反应结果的影响。使用模拟样本和实际样本评价新方法的检测效用。结果 双重荧光定量PCR方法具有良好的灵敏度和特异度,与单重实验方法比较,检测Ct值无明显差异(P>0.05),病原浓度与检测Ct值具有良好的线性相关关系。两种病原浓度差异和其他病原的存在对检测结果无明显影响。使用该方法检测模拟蜱样本和实际蜱样本具有良好的实用性。结论 本实验建立的多重荧光定量PCR方法能快速便捷的检测两种疏螺旋体,为蜱样本病原鉴定提供了有价值的检测工具。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

嗜水气单胞菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立快速准确检测致病性嗜水气单胞菌的双重荧光定量PCR方法。方法针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和气溶素基因aerA的序列设计特异性引物及TaqMan探针,优化双重荧光定量PCR反应条件,并结合常规PCR方法及分离培养鉴定对临床样品进行检测和对比验证。结果荧光定量PCR反应体系对质粒标准品的敏感性为10拷贝/反应,是常规PCR检测方法的100倍;该方法检测12种其他种属细菌时未出现假阳性;对实际样品的检测结果其敏感性同样高于普通PCR,定量检测目的基因的拷贝数与样品中目的菌的分离率成正比。结论本方法敏感性高,特异性好,可用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究。     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％;TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析。     

牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法根据分枝杆菌的插入序列IS1081设计引物和探针,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验,并用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该方法的敏感性达到了10个拷贝,且特异性高,重复性好。对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性;而对PPD检测阳性,巢式PCR检测为阴性的15份临床样本进行检测时,2份为阳性;在对2份PPD检测阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性。结论成功建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法,对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义。     

豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立测定豚鼠肺脏中TNF、IFN-γ、IL-1的荧光定量PCR方法。方法根据已有序列设计TNF、IFN-γ、IL-1基因检测引物,建立荧光定量PCR检测方法。结果用建立的荧光定量PCR检测豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1基因的溶解曲线峰值单一,扩增水平稳定。结论成功建立了检测豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1基因的荧光定量PCR方法,为豚鼠先天免疫方面研究提供技术支持。     

实时荧光定量PCR检测GI型诺瓦克样病毒方法的建立

目的建立临床粪便中GI型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法。方法针对诺瓦克样病毒GI型保守序列,用序列比对软件设计特异性引物与探针,建立诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法。并用常规RT-PCR和本文建立的实时荧光定量PCR对137份临床腹泻标本进行检测。结果该方法对诺瓦克样病毒检测准确,重复性好,标准曲线的线性范围为102～107拷贝,相关系数为0.9991。并且对临床标本的检出率显著高于普通RT-PCR。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于检测临床腹泻粪便标本中的GI型诺瓦克样病毒,从而有效预防和控制该病毒的传染。     

蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立

目的 建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法 针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果 该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在10⁹ copies/μL10¹ copies/μL之间线性关系良好(R²=0.99),批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论 建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价值。     

Design of a multiplex PCR method for detection of toxigenic-pathogenic in Vibrio cholerae

ObjectiveTo study virulence and regulatory genes (hlyA, ctxB, tcpI) in clinical strains of Vibrio cholerae (V. cholerae), simultaneously.MethodsThree important genes, tcpI, hlyA and ctxB were used for detection of toxigenic and pathogenic V. cholera by chain reaction assay method.ResultsAccording to the results of the PCR, the incidence of hlyA, tcpI, and ctxB genes in clinical isolates was obtained as 94.7% (72 sample), 90.8% (69 sample), and 92.1% (70 sample), respectively. Five strains possessed all genes except ctxB, six strains possessed all genes except tcpI, four strains possessed all genes except hlyA, one strain possessed only hlyA and 60 strains contained a combination of three genes, Including hlyA, ctxB and tcpI.ConclusionsResult show that this method could be reliable to detect toxigenic-pathogenic strains of V. cholerae in Iran.     

Development and testing of cholera enterotoxin gene probe for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1

A DNA probe was developed for the genetic detection from cholera enterotoxin (CT) producing Vibrio cholerae O1 and other organisms. The structural genes of CT (ctx) were cloned from chromosomal DNA of CT producing V. cholerae O1 569B. We subcloned a 552-base-pair fragment encoding a part of CT A-subunit for use of the CT-probe, and made the recombinant plasmid called pSKM24 which has eight copies of the CT-probe. The 32P-labeled CT-probe detected ctx in 72 isolates such as V. cholerae O1, V. cholerae non-O1 and other species of bacteria, but did not react heat-labile enterotoxin genes in enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) by DNA hybridization. The colony hybridization test using the CT-probe is specific, rapid and useful technique for detection of ctx and identification of CT producing V. cholerae.     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

Are the environmental niches of Vibrio cholerae O139 different from those of Vibrio cholerae O1 El Tor?

BACKGROUND: Vibrio cholerae are known to be normal inhabitants of surface water. However, the environmental niches of the different strains of cholera are not well known, and therefore, populations at risk for cholera outbreaks cannot be clearly identified. METHODS: This study identifies environmental risk factors for cholera caused by V. cholerae O1 El Tor and O139 and environmental niches of the two strains present in Matlab, a cholera endemic area of Bangladesh. The study year was 1993, the year that the O139 strain first appeared in the study area. Patients who had either strain of cholera identified in a laboratory were included in the study. A geographic information system was used to map the household locations of the patients, to describe the human sanitary environment and population density, and to address potential anthropogenic and environmental risk factors of the disease. Spatial point pattern and exploratory spatial data analysis techniques were used to define the environmental niches of the two cholera strains. RESULTS: The study suggests the niches of O1 El Tor and O139 strains of V. cholerae appear to be similar, based on common environmental risk factors. CONCLUSIONS: The results of this study support a theory that O1 El Tor could possibly be replaced by the newer O139 strain in the future.     

人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用

目的本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法。方法以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证。结果　设计实验找到最优条件下的引物浓度(250 nmol/L)、探针浓度(300 nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性。该方法的最低检测量为5 copies/μL。对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1%,重复性好。用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100%。结论本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗霍乱弧菌O139血清群rMSHA多克隆抗体。方法用经Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白(rMSHA)免疫日本大耳兔,收集免疫兔血清。Western Blot检测重组蛋白的免疫原性;ELISA测定该抗体的效价。结果兔抗rMSHA抗体能与重组蛋白发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶25 600。结论成功地制备了兔抗rM-SHA抗体,该抗体能够识别原核表达的重组蛋白rMSHA,为研制霍乱弧菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

Real-Time PCR探针法定量检测沙门菌方法的建立及应用

目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。     

Detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 using polymerase chain reaction for amplifying the cholera enterotoxin gene

A rapid and simple procedure using polymerase chain reaction (PCR) was developed for the detection of cholera enterotoxin (CT) producing character. This method is based on amplifying a 380 base pair (bp) segment of the CT gene (ctx) which controls the production of CT. Two single-stranded oligonucleotides, synthetized to be complementary to the known nucleotide sequences of genes encoding the A-subunit of ctx, were used as extension primers. The oligonucleotide sequences are 5'TCAAACTATATTGTCTGGTC (CT-1) and 5'CGCAAGTATTACTCATCGA (CT-2). As template DNA was used 5 microliter of boiled bacterial culture broth at 95 degrees C for 5 min without the need for DNA extraction. The amplified target DNA were confirmed with only CT producing Vibrio cholerae O1 but not with CT non-producing organisms such as heat labile enterotoxin producing Escherichia coli by electrophoretic analysis of PCR mixture after amplification. A few isolates of CT producing V. mimicus and V. cholerae non-O1 were identified.