骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新、分化、增殖的和多向分化的潜能。在体内、体外通过各种物理、化学因素可将其诱导分化为心肌细胞。以此来替代坏死的心肌细胞,改善心脏功能,防治各种缺血性心脏病,减少心肌重构等,具有广阔的临床应用前景。     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的：初步观察MSCs墨体内诱导分化为心肌细胞的能力。方法：从大鼠双侧股骨骨髓获得MSCs，在体外纯化、扩增后，DAPI进行细胞标记，然后注射到急性心肌梗塞模型鼠和正常大鼠的心肌组织内，饲养2～4周后，处死动物在注射点获取心肌标本，初步采用肛染色和电镜观察形态学的方法对分化的心肌细胞进行鉴定，并用免疫组化法从组织学上对转化心肌细胞进行心肌特异性抗原的检测。结果：MSC进行DAPI的标记效率高，电镜观察与宿主心肌细胞问形成了闰盘，组化检测有心肌特异性抗原的出现。结论：在宿主心肌组织内，MSCs具有分化为心肌细胞的能力。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展

心血管疾病是威胁人类生命健康的主要疾病之一，据统计，目前全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中约有一半以上的人死于心肌梗死。目前的治疗方法包括药物治疗、冠状动脉旁路移植、经皮球囊介入治疗等，只能恢复再灌注挽救缺血顿抑的心肌，但不能使已经梗死的心肌再生。近年来人们一直在寻求着解决这一问题的办法，而干细胞技术的发展，为这类疾病的治疗带来了新的希望。     

骨髓间充质干细胞的克隆培养及其向心肌细胞的诱导分化

目的 建立骨髓间充质干细胞(MMSC)的单细胞克隆，筛选具有心肌特异性分化潜能的c-kit^ MMSC克隆，进行体外心肌诱导分化研究。方法 取成年雄性SD大鼠骨髓细胞，进行原代培养和单克隆培养。通过c-kit免疫细胞化学标记和RT—PCR检测，筛选出向心肌特异性分化的MMSC克隆。然后用5-氮杂胞苷诱导分化，RT-PCR检测诱导前后心肌特异性基因表达的变化。结果 骨髓中含有多种MMSC克隆，以不同形态和大小的成纤维细胞样克隆数目最多。较大的成纤维细胞样克隆和扁平多角形细胞克隆均表达c-kit。用5-氮杂胞苷诱导后，表达Nkx2．5的c-kit^ MMSC克隆的细胞形态和排列方式发生变化。诱导后2周，细胞变为短柱状，且平行排列；第3周，相邻细胞间形成明显的细胞连接；第4周，由多个细胞相互连接形成肌管样结构，并可观察到肌管的自发性搏动。心室肌特异性肌球蛋白轻链(MLC-2v)mRNA从第3周开始明显表达。结论 骨髓中含有多种干细胞克隆。筛选具有心肌特异性分化潜能的MMSC克隆并构建心肌干细胞库，将为临床干细胞移植治疗心肌梗死提供理想的干细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

骨髓间充质干细胞在心肌细胞诱导下的分化研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同心肌细胞微环境作用下,向心肌样细胞分化能力。方法将心肌细胞与BMSCs分为：接触性、非接触性、对照组联合培养;2周后检测各实验组细胞中,心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）表达情况。结果免疫细胞化学鉴定：1）接触性联合培养组细胞均表达cTnT;2）非接触性联合培养组细胞均表达cTnT;3）对照组细胞不表达cTnT。     

不同比例心肌细胞诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化的实验研究

目的观察不同细胞比例条件下,心肌细胞(CMs)间接接触对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样分化的诱导作用,以确定较高的诱导比例。方法分离培养大鼠BMSCs,与CMs分别以1:1、1:2、1:4、1:5、1:10的比例在体外共培养,14d后采用实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测各个比例下BMSCs中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。结果各比例组BMSCs中的cTnT均有一定表达,且表达量随着比例的升高而增加。结论在共培养条件下,不同比例条件下的CMs对BMSCs成心肌样分化的诱导作用不同,随着比例的增加而增强。     

骨髓间充质干细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem ceus，BMSCs)是骨髓中除了造血干细胞之外的另一类干细胞，目前常用的培养方法有全骨髓培养法和密度梯度离心法，但是还没有特异性的鉴定指标。BMSCs具有成骨、软骨、神经细胞等多种组织系统分化的潜能，即具有可塑性，但这种可塑性仍存在很多争议。     

Nesprin-1对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的影响

目的探讨nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的作用。方法采用悬滴-悬浮-贴壁三步法,5-氮杂胞苷(5-aza)与丹参共同诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,用Western blot与免疫荧光技术检测nesprin-1蛋白表达水平和在分化成熟过程中的改变。同时利用RNA干扰(RNAi)技术抑制nesprin-1蛋白的表达:Ⅰ组(RNA干扰目的序列AAAGCCAAGCACGCAACTA),Ⅱ组(RNA干扰目的序列GGGAACCAACAGTGAGATT),Ⅲ组(RNA干扰目的序列ACCAGGACATTGCGTACTA),对照组(使用无意义的ShRNA干扰序列),观察对胚胎干细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达水平有所变化。RNAi后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组心肌细胞分化率分别为(17.78±1.92)%、(36.67±3.34)%、(44.42±5.08)%和(77.78±1.92)%,各干扰组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),且各干扰组分化后心肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白(myosin)的表达量减少。结论 Nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中发挥重要作用,不同分子大小的nesprin-1亚型在此分化过程中可能有着不同的功能。     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离、培养及向心肌细胞诱导分化的条件。方法：抽取兔髂骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化MSCs，第3代细胞（P3）用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b，CD90、CD29。以10μmol／L5-氮胞苷（5-aza）进行诱导分化，4周后，用倒置显微镜、透射电镜观察MSCs形态学变化及超微结构特征，RT—PCR检测心肌特异性β-肌球蛋白重链（β—MHC）、肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：兔MSCs呈贴壁集落生长，流式细胞术检测显示P3细胞均一性在97％以上，纯度较高。诱导后细胞体积较诱导前增大，更加细长。14天后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。4周后，透射电镜下有肌丝、心房特殊颗粒及线粒体等心肌细胞超微结构形成。RT—PCR显示B—MHC、cTnI呈阳性反应。结论：MSCs在体外经5-aza诱导可以向心肌细胞进行分化。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)-2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P₂、P₄、P₇）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P₂、P₄间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P₇与P₂、P₄相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论BMP-2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。     

电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞向心肌方向诱导分化的研究

【目的】观察脉冲电磁场（PEMFs）对5-氮胞苷（5-aza）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响。【方法】50Hz脉冲低频电磁场刺激5-aza诱导7d后的MSCs,根据不同的感应强度和作用的时间分为A、B、C组和1、2、3、4亚组,设未暴露PEMFs的为对照组。通过Western印迹法检测不同条件下心肌肌钙蛋白T的变化。【结果】0．5、1和5mT组中20min、30min各亚组cTnT的表达量较对照组,5mT组在10min的表达量减少。【结论】50Hz的0．5～5mT感应强度的PEMFs作用20～30min为促进体外5-aza诱导MSCs向心肌方向的分化的有效窗口。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的表达

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)端粒酶活性的表达以及深低温冻存和向脂肪细胞诱导分化对基因表达的影响.方法:联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离人hMSCs,传代培养.深低温冻存hMSCs或诱导其向脂肪细胞分化,以TRAP(Telomerase repeat amplification protocol assay) 法分别检测新鲜的不同传代次数的hMSCs、冻存复苏后培养的hMSCs和诱导分化为脂肪细胞的hMSCs的端粒酶活性.结果:用TRAP法检测hMSCs(n=19)端粒酶活性(RTA)是(1.46±0.67)%,分化成脂肪的hMSCs(n=3)的RTA为(11.80±2.52)%(P<0.001);不同传代次数MSCs端粒酶活性的比较中,早期hMSCs(n=10)的RTA为(1.46±0.83)%,晚期hMSCs(n=9)的RTA为(1.46±0.47)%(P=0.99);在低温冻存对hMSCs端粒酶活性的影响中,新鲜的hMSCs(n=13)的RTA为(1.41±0.44)%,低温冻存的hMSCs(n=6)的RTA为(1.57±1.07)%(P=0.64).结论:hMSCs的端粒酶呈阴性,传代培养和低温冻存不影响基因表达水平.向脂肪细胞分化后hMSCs端粒酶活性表达水平增高,其确切机制尚需进一步研究.