磁刺激对小鼠原代海马神经元突触素、生长相关蛋白及脑源性神经营养因子表达的影响

目的观察磁刺激对原代海马神经元形态及突触素(SYN)、生长相关蛋白43(GAP43)、脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,探讨磁刺激对突触可塑性的影响及可能机制。方法原代海马神经元随机分为对照组、假刺激组及40%(1Hz,0.76T)、60%(1Hz,1.14T)、80%(1Hz,1.52T)最大磁刺激输出强度组,各刺激组自细胞接种后第2～6天接受磁刺激,连续5d;假刺激组置于相同磁场装置环境,但不接受磁刺激。各组细胞于第7天相同时间取材。采用扫描电镜、细胞免疫荧光法、蛋白质印迹及RT-PCR等方法观察神经元形态变化及SYN、GAP43与BDNF蛋白、mRNA的表达。结果 40%强度组神经元突起长度增长、胞间神经联系增多,SYN免疫反应性、BDNF免疫反应性及蛋白表达均高于对照组(P<0.05,P<0.01),GAP43免疫反应性及蛋白水平未见明显升高,SYN、GAP43与BDNF mRNA表达量高于对照组(P<0.05);60%强度组突起长度与数量增加(P<0.01)、交织成密集网络,SYN、GAP43与BDNF免疫反应性、蛋白及mRNA表达量均高于对照组(P<0.01);80%强度组突起数目、长度增加,同时有细胞损伤现象,GAP43免疫反应性、BDNF免疫反应性及蛋白水平高于对照组(P<0.05,P<0.01),SYN免疫反应性及蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义,SYN、GAP43及BDNF mRNA表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论磁刺激通过促进原代海马神经元BDNF的合成或分泌,上调SYN、GAP43的表达,影响神经元形态,可能在调控突触可塑性、促进神经网络构建方面发挥重要作用;不同磁刺激参数刺激效果不同。     

氟西汀对海马神经元生长的影响

目的研究不同浓度氟西汀对体外培养的新生大鼠海马神经元生长的影响。方法进行新生SD大鼠海马神经元原代培养,采用烯醇化酶(NSE)免疫组织化学和尼氏染色鉴定海马神经元。在培养3 d的海马神经元中加入不同浓度(1、10、20、40μmol.L-1)的氟西汀,并设正常对照组,48 h后观察细胞有突起的神经元数目、突起长度和胞体长径。研究氟西汀对海马神经元生长的影响。结果10μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长(P<0.05);40μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起神经元数目减少(P<0.05),最长突起长度及胞体长径无统计学差异(P>0.05);1μmol.L-1、20μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无统计学差异(P>0.05)。结论一定浓度的氟西汀能促进海马神经细胞的生长。     

新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

白介素-1β对原代培养海马神经元毒性的研究

目的 探讨IL-β对体外培养的海马神经元活性及合成和分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的影响.方法 采用SD新生鼠进行海马神经元原代培养.培养7d的细胞以细胞免疫化学法枪测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,计算阳性细胞率.实验分IL-β为0ng/ml的正常组和IL-β为5 ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 3个实验组,进行海马神经元无血清培养48 h.采用甲基噻唑基四唑(MTT)试验检测细胞活性,ELISA法检测培养上清BDNF的含量.结果 NSE细胞免疫化学鉴定显示阳性细胞达到90%以上;IL-1β降低体外培养的海马神经元活性,各剂量组按浓度在590nm波长处检测OD值为(0.5585±0.2407; 0.4295±0.1401; 0.4191±0.1050),与正常组(0.9462±0.2972)比较,差异具有显著性(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01 ANOVA);IL-1β降低体外培养的海马神经元合成和分泌BDNF水平,各剂量组显著BDNF含量分别是[(8.65±0.71)pg/ml,(8.90±0.35)pg/ml,(7.90±0.35)pg/ml],与正常组(12.40±1.77)pg/ml比较差异具有显著性(均P<0.05 ANOVA).结论 IL-1β可导致体外培养海马原代神经元的损伤,其机制可能与海马神经元合成和分泌BDNF的减少有关.     

原代SD大鼠海马神经元扫描电镜形态学特点

目的:观察体外培养的原代海马神经元扫描电镜形态学特点。方法:体外培养新生SD乳鼠原代海马神经元,行免疫细胞化学鉴定,用扫描电镜观察其形态学特点。结果:培养的海马神经元形态多样,梭形神经元胞体较大,伸出两个突起;神经元细胞有的基底宽广,突起有粗有细,与周围的神经元细胞连结紧密;锥体细胞从胞体发出2～3个突起,从粗大的突起上又分出突起;培养的神经元以锥体形为主,其次为梭形、三角形。结论:培养的神经元为MAP-2染色阳性,扫描电镜可见神经元胞体及突起形成神经元的特有结构。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

大鼠睾丸支持细胞对培养海马细胞的作用

目的 研究睾丸支持细胞对于体外培养大鼠海马细胞的促进生存作用.方法 新生SD大鼠海马细胞常规酶解分离培养,12～16 d SD大鼠支持细胞采用二步酶消化和低渗分离培养,海马细胞培养分为DMEM组、支持细胞培养液(SCM)组、与支持细胞共培养组.结果 SCM组和支持细胞共培养组生存贴壁神经元数量均高于单纯DMEM组,随着培养时间的延长,3组神经元数量均逐渐减少,但神经元的平均突起数量均随时间的延长而增多,且同一时间SCM组和支持细胞共培养组生存神经元数量及平均突起数量均显著高于DMEM组,支持细胞共培养组神经元树突数量较SCM组明显增加.结论 支持细胞及其产生的可溶性因子可促进培养的海马神经元的生存和促进突起生长.     

GFP转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立

目的建立一套稳定、成熟的绿色荧光蛋白（GFP）转基因胚胎小鼠海马神经元体外原代培养的方法，搜集培养神经元的形态资料，为今后的GFP转基因小鼠海马神经元培养后移植治疗神经系统等疾病提供重要的理论和实践依据．方法采用体外培养法对取材于GFP转基因小鼠海马的神经元进行培养，用其特异的抗体免疫组化鉴定后，分别于倒置相差光学显微镜及荧光显微镜下观察，培养细胞可存活1个月以上，5—7d左右细胞生长最好，神经突起多而粗大，分支互成网络，14d后生长减缓．结果建立了成功的海马神经元培养方法，经免疫组化证实为海马神经元，在培养后的不同阶段海马神经元生长良好．结论该培养方法成熟稳定。不失为培养GFP转基因小鼠的一种良好的方法，值得借鉴和推广．     

活性氧介导大剂量氯胺酮致原代培养皮层神经元凋亡

目的:观察活性氧(ROS)是否参与大剂量氯胺酮致原代培养皮层神经元凋亡?方法:单纯培养基(C组)?1 mmol/L氯胺酮(K组)?1 mmol/L氯胺酮复合2.5 μmol/L超氧化物歧化酶类似物M40403(M组)分别作用于体外原代培养第6天的神经元24 h,检测神经元ROS生成?凋亡细胞百分比及促凋亡蛋白Bax表达?结果:与C组相比,K组神经元ROS生成?凋亡细胞百分比?Bax表达分别是其1.7?4.2及2.0倍(P < 0.05);与C组相比,M组神经元ROS生成?凋亡细胞百分比?Bax表达差异无统计学意义?结论: ROS介导大剂量氯胺酮致原代培养皮层神经元凋亡?     

C57BL/6胎鼠大脑皮质神经元体外培养与鉴定

【摘要】目的探讨近交系C57BL／6胎鼠皮质神经元体外培养方法,观察其生长情况,并进行鉴定。方法分离孕17dC57BL／6胎鼠大脑皮质,剪碎吹打,静置取上清液,余组织块以木瓜酶和DNaseI消化,差速贴壁提纯,培养6h后以添加含谷氨酰胺和B27的Neurobasal培养基继续培养,观察其生长情况,并于体外培养3、5d时,以神经元特异性核蛋白（neuronspecificnuclearprotein,NeuN）和微管相关蛋白一2（microtubule-associatedprotein-2,MAP-2）为标志物,用免疫荧光双染法对分离培养的原代细胞进行鉴定。结果体外培养6h细胞已贴壁,少量细胞发出l～3个短小突起;此后神经元相继发出突起、并伸长,与邻近细胞突起互相接触,培养5d突起已互相交织成网;体外培养3、5d的NeuN阳性细胞率分别为（94．1±5．0）％、（95．0±5．6）％;MAP一2阳性细胞率分别为（96．7±2．9）％、（95．6±5．6）％,NeuN、MAP-2阳性细胞率差异无统计学意义（P〉0．05）,NeuN和MAP-2鉴定结果一致性好。结论本方法制备的C57BL／6胎鼠皮质原代神经元纯度高,损伤小,生长发育状态良好,无明显增殖性,可作为神经元体外研究的良好实验材料。     

重复经颅磁刺激安全性的初步研究

目的 探讨重复经颅磁刺激的安全性。方法 对接受不同刺激频率和刺激量组经颅磁刺激大鼠的行为、组织病理形态、血清髓鞘碱性蛋白（MBP）及神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量进行观察。结果 低频刺激组（5Hz）和高频刺激组（20Hz）在刺激过程中均未出现异常活动,无肢体强直、阵挛等,脑组织形态学包括大体观察、普通光镜改变不明显,其血清MBP和NSE含量与正常对照组比较,无显著性差异（P＞0．05）。结论 在一定强度和频率内经颅磁刺激是比较安全的。     

背景噪声对清醒小鼠初级听皮层神经元听觉响应特征的影响

目的 探究不同强度持续噪声背景对清醒小鼠初级听皮层神经元听觉反应特征的影响。方法 以清醒小鼠初级听皮层（A1）第4层神经元为研究对象,采用细胞外贴附式记录方式,研究清醒状态下A1神经元在不同强度背景噪声下对声刺激发生响应的声强调谐、频率调谐和时间调谐特征的变化。总计44例神经元均进行5种目标声刺激序列扫描,根据神经元的声强响应特征和目标声序列扫描完成情况,将神经元分为4组：单调性-声强组20例、非单调性-声强组6例,完成声强-噪声强度序列扫描;单调性-频率组25例,完成频率-噪声强度序列扫描;单调性-延时组15例完成延时-噪声强度序列扫描。 结果 给予持续宽带白噪声刺激,44例A1听神经元仅在给声后10~40 ms内出现瞬态的尖峰响应,不同强度的背景噪声对A1神经元的发放率无明显影响（P>0.05）;单调性和非单调性-声强组,给予不同声强的目标声叠加持续背景噪声时,当背景噪声增强到一定程度,26例神经元对目标声刺激发生响应的声强阈值随背景噪声强度变化表现出线性增大（线性回归R2值均>0.90,P值均<0.05）,各神经元的阈值变化斜率差异较大,但单调性和非单调性神经元群体之间的阈值变化趋势无明显差异（P>0.05）;A1非单调性神经元的最佳声强也随背景噪声增强而增大,其变化斜率与该神经元声强阈值的变化趋势呈正相关（相关系数0.944,P<0.001);单调性-频率组,给予不同频率的目标声叠加持续背景噪声时,随背景噪声强度增大,神经元频率响应带宽减小（P<0.001）,平均发放率减小（P<0.001）,而最佳频率基本不变（P<0.001）;单调性-延时组,噪声背景的增强使得神经元对同一声刺激的响应延时增大（P<0.05）,但首个动作电位发放时间的精确性不发生改变（P>0.05）。结论 在不断增强的噪声背景中,清醒小鼠A1神经元的声强响应阈值表现出线性升高,其变化斜率存在较大的个体差异,但与神经元的声强响应特征（单调或非单调）无关。增强的背景噪声压缩了A1神经元的频率响应范围,延长了神经元对目标声的响应时间,但神经元的频率选择性和对同一目标声发生反应的时间精确性不受噪声背景的干扰而保持稳定。     

电刺激海马对缰核痛反应神经元放电的影响

有资料报道刺激海马可使动物痛阈升高并加强针刺镇痛效应,外侧缰核为前脑边缘系统至脑干的联系驿站,在针刺镇痛中起重要作用。本工作在大鼠外侧缰核中记录了65个痛兴奋神经元,15个痛抑制神经元和42个痛无关神经元的自发放电和痛诱发放电。观察到电刺激海马对71％的痛兴奋神经元和全部痛抑制神经元产生抑制作用。只对45％的痛无关神经元产生抑制作用。无一例缰核神经元放电被刺激海马所兴奋。设想海马的活动可改变缰核—中缝大核系统的兴奋性从而调制着痛觉冲动的传递。     

Biological properties of neural progenitor cells isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys

Background The existence of neurogenesis in the hippocampus of adult nonhuman primates has been confirmed in recent years, however, the biological properties of adult neural stem cells or neural progenitor cells （NPCs） from this region remain to be extensively explored. The present work was to investigate on the expansion of NSCs/NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys and the examination of their characteristics in vitro. Methods NPCs isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys were expanded in vitro in serum-free media containing growth factors, and were then allowed to differentiate by removing mitotic factors. The expansion capacity of NPCs and their differentiation potential were assayed by immunohistochemical and immunocytochemical analysis. Results During primary culture, NPCs underwent cell division, proliferation and aggregation to form neurospheres that were growing in suspension. Without mitotic stimulation, most neurospheres adhered to the culture dish and started to differentiate. Eventually, nearly 12% of the differentiated cells expressed neuron specific marker-β Ⅲ-tubulin （Tuj1） and 84% expressed astrocyte specific marker-fibrillary acidic protein （GFAP）. In addition, the expression of a neural stem cell marker, nestin, was found both in NPCs and in the subgranular zone of adult monkey hippocampus, where NPCs were originally derived. Conclusions NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys can be expanded to some extent in vitro and are capable of differentiating into neurons and astrocytes. Further experiments to promote the in vitro proliferation capacity of NPCs will be required before adult NPCs can be used as a useful cell model for studying adult neurogenesis and cell replacement therapy using adult stem cells.     

胃动素对大鼠海马神经元放电活动的影响

目的研究大鼠海马胃扩张神经元的特点及胃动素对胃扩张神经元放电活动的影响。方法采用微电极细胞外记录方法在体观察胃动素是否对82只大鼠海马胃扩张(GD)神经元放电有影响,胃扩张神经元根据刺激后的变化可分为胃扩张兴奋性神经元和胃扩张抑制性神经元。结果①在82只大鼠上记录到的358个海马单位电活动,根据神经元放电模式可分为位相性、连续性和单个性。神经元放电频率可分为:高频(>10Hz)、中频(5～10Hz)和低频(0～5Hz)。②海马内358个对GD刺激有反应的171个GD神经元中,放电频率增加的海马神经元有130个(70.5±4.8)%,为GD兴奋性神经元(GD-E);GD引起海马神经元放电频率减少的神经元41个(-60.3±4.2)%,为GD抑制性神经元(GD-I);③海马CA1区内的66个GD-E神经元中有38个(57.6%)对胃动素呈现兴奋性效应;在18个GD-I神经元中有10个神经元(55.6%)表现为兴奋效应,6个神经元放电频率降低。结论海马区有胃扩张反应性神经元;胃动素对海马胃扩张神经元有兴奋作用。     

狂犬病病毒街毒株对体外培养小鼠海马神经元的损伤作用及其机制

目的：探讨狂犬病病毒街毒株（RV）感染神经细胞的形态学表现,揭示狂犬病病毒致神经功能异常的机制。方法：体内实验,20只C57/BL小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组小鼠脑内接种30 μL　RV病毒液（10TCID50）,对照组小鼠脑内接种等量细胞维持液,利用抗RV抗体检测病毒抗原在小鼠脑组织的分布。体外实验,培养原代海马神经细胞,培养1周后,感染狂犬病病毒,免疫荧光检测感染72、96和120 h后病毒的增殖情况。结果：体内实验,狂犬病病毒感染4 d后,在海马CA1区锥状神经元胞体和树突中均能检测到狂犬病毒抗原;狂犬病病毒感染7 d后,仅在海马CA1区胞体中检测到狂犬病病毒抗原。体外实验,狂犬病RV感染体外培养的原代神经细胞120 h后,感染的神经元数量最多,且感染的神经元树突数量减少。结论：狂犬病RV可感染、损伤海马CA1区树突,从而引起小鼠神经功能异常。     

绞股蓝总皂苷对血管性痴呆大鼠海马一氧化氮合酶及核酸的保护作用

目的 观察绞股蓝总皂苷(GP)对血管性痴呆(VD)大鼠海马神经元型一氧化氮合酶(nNOS)及核酸的保护作用。方法 采用改良的Pulsinelli 4-血管阻断(4-VO)方法建立大鼠VD模型，用免疫组化法研究GP对大鼠海马nNOS的表达的影响，并用吖啶橙染色法进行GP对VD大鼠海马的DNA和RNA保护作用的研究。结果 与正常对照组比较，VD大鼠海马CA1区和CA3区nNOS阳性神经元数目明显减少，而DNA和RNA吖啶橙染色后的荧光强度(反映DNA和RNA含量)明显减弱，GP 200 mg／kg ig给药组海马各亚区的nNOS阳性神经元神经细胞数比VD模型组明显增多。DNA和RNA吖啶橙染色后的荧光强度强于VD模型组，与正常对照组相似。结论 GP可明显增强VD大鼠海马nNOS阳性神经元的表达，并对DNA和RNA有保护作用。     

舒郁胶囊对大鼠海马神经元5-HT3R激活后Ca~(2+)的影响

目的:观察海马神经元内5-羟色胺3受体(5-HT3R)激活后信号通路中Ca2+浓度的变化,探索复方舒郁胶囊治疗抑郁情绪的微观作用机制。方法:培养大鼠海马神经元,在中药血清药理学指导下进行实验:于培养基中添加5-HT3R激动剂激活其介导的信号通路,再以一定浓度舒郁胶囊和柴胡提取物含药血清孵育神经元。采用荧光探针Fluo-3/AM标记结合激光共聚焦显微镜技术测定海马神经元胞内[Ca2+]i。结果:激动剂激活5-HT3R信号通路,神经元胞内[Ca2+]i显著升高(P0.01)。给予正常大鼠舒郁胶囊和柴胡提取物含药血清干预,再次激活信号通路,胞内[Ca2+]i与正常组相比无明显变化,较激动剂组显著降低(P0.05)。结论:舒郁胶囊通过5-HT3R调控海马神经元胞内[Ca2+]i的变化,可能是其治疗抑郁情绪的作用机制之一。