MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的：探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法：将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞，观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化；用RT-PCR和Western blot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果：MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化；RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD；Western blot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论：MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞，为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。     

MyoD基因诱导大鼠成纤维细胞转化为成肌细胞的研究

目的探讨MyoD在体外诱导大鼠成纤维细胞分化为成肌细胞中的作用。方法将大鼠成纤维细胞分成2组：未转染组（N组）和MyoD基因转染组（M组）;利用慢病毒表达系统,将大鼠MyoD基因转入大鼠成纤维细胞中,Blasticidin筛选;用RT-PCR和Western blot检测MyoD的表达;免疫组织化学检测MyoD、desmin及-αactin的表达;电子显微镜观察转染前后细胞形态的变化。结果RT-PCR和Western blot可检测出MyoD基因转染后细胞表达MyoD mRNA及蛋白质;免疫细胞化学检测MyoD表达在基因转染的细胞中为阳性,desmin、α-actin阳性表达只出现在M组;电子显微镜观察转染后的细胞胞浆中有微丝以及微管等结构。结论MyoD基因可诱导大鼠成纤维细胞分化成的细胞具有成肌细胞特征,为进一步研究MyoD基因诱导的成肌细胞及在大鼠心梗损伤修复中的作用提供了实验基础。     

早期糖尿病大鼠肾小球中纤维连接蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的表达

采用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病 (DM)模型 ,观察 DM形成后 1、2、4周肾小球中纤维连接蛋白(FN)和碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)的表达。结果 :FN在 DM1周和 2周鼠肾小球内的表达无明显变化 ;在第4周 ,FN除了系膜区染色明显加深外 (P<0 .0 5 ) ,还出现了肾小球基底膜的强染。在第 1周 ,模型鼠肾小球系膜区b FGF染色较正常加强 (P<0 .0 5 ) ,第 2周恢复到基础水平 ,第 4周在系膜区又出现了较 1周时更强的表达 (P<0 .0 5 )。上述结果提示 ,DM早期肾小球内即有细胞外基质的堆积 ,FN为一敏感指标 ;b FGF后期表达上调与 FN沉积有关。     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的 探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡，是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人FaseDNA插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点之间，以脂质体介导法将目的基因导人瘢痕疙瘩成纤维细胞，FasmAb诱导凋亡；通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果 转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经FasmAb作用后，在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂；琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带；流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常，是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成，与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起．其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒的构建和鉴定

目的 构建含鼠连接蛋白43基因的真核表达重组质粒。方法 从胎鼠中提取总RNA，经RT-PCR方法获得并扩增含全部编码序列的连接蛋白43cDNA片段，将其克隆到pBudCE4．1真核表达载体上，并进行酶切鉴定和测序分析。结果 RT-PCR技术扩增出约1．1kb的连接蛋白43基因全部编码序列的片段。测序分析证实所插入连接蛋白43基因片段的序列完全正确。结论 鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒成功构建。     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

纤维连接蛋白对大鼠肺成纤维细胞纤维连接蛋白和整合素α5β1表达的影响

目的　研究纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)及其受体整合素α5β1在肺纤维化中的作用。方法　应用Northern印迹杂交和免疫细胞化学技术。结果　经FN作用 2h ,肺成纤维细胞α5β1和FNmRNA的杂交信号均增强 ,6h达最高值 ;FN作用 6、1 2、2 4h ,免疫细胞化学染色显示整合素α5β1、FN蛋白的表达增强 ;经α5单克隆抗体预作用 ,FN作用组的肺成纤维细胞整合素α5β1和FN蛋白表达减弱 ,其抑制作用依次分别在 6h(α5β1)、1 2h(FN)最明显。结论　FN能直接刺激肺成纤维细胞合成FN或通过上调整合素α5β1的表达来促进自身合成FN。     

纤维连接蛋白对大鼠肺成纤维细胞纤维连接 蛋白和整合素α5β1表达的影响

目的研究纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及其受体整合素α5β1在肺纤维化中的作用。方法应用Northern印迹杂交和免疫细胞化学技术。结果经FN作用2h,肺成纤维细胞α5β1和FNmRNA的杂交信号均增强,6h达最高值;FN作用6、12、24h,免疫细胞化学染色显示整合素α5β1、FN蛋白的表达增强;经α5单克隆抗体预作用,FN作用组的肺成纤维细胞整合素α5β1和FN蛋白表达减弱,其抑制作用依次分别在6h(α5β1)、12h(FN)最明显。结论FN能直接刺激肺成纤维细胞合成FN或通过上调整合素α5β1的表达来促进自身合成FN。     

TNF-α诱导心肌成纤维细胞增殖的信号转导机制研究

目的研究TNF-α诱导心肌成纤维细胞增殖的信号转导机制,为设计早期防治心肌梗死和心衰的药物提供分子靶点。方法心肌成纤维细胞体外原代和传代培养后,用不同浓度的TNF-α刺激心肌成纤维细胞一定时间,用Western blot检测细胞膜Gq蛋白的表达;放射免疫方法测定细胞内三磷酸肌醇（IP3）的表达;薄层层析分析法测定细胞内DAG水平;免疫组化技术检测细胞内PKC的含量;流氏细胞方法检测细胞内Ca2＋的释放;MTT法检测细胞增殖水平。结果 F-α能不同程度的诱导细胞Gq蛋白、IP3、Ca2＋、DAG和PKC的增加,并表现了明显的时间-效应关系。剂量效应关系显示：20ng/ml TNF-α对Gq蛋白、IP3、PKC结果的影响较其它两个剂量组明显（P〈0.05）,而细胞内DAG和Ca2＋的水平在各剂量组间无明显差异,但与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。在这些信号物质改变的模式下,心肌成纤维细胞增殖水平较对照组明显增高（P〈0.05）。结论α通过激活细胞膜Gq蛋白介导的IP3/Ca2＋和DAG/PKC途径诱导心肌成纤维细胞增殖,并以20ng/mlTNF-α较明显。     

Ag43／FGFR-1嵌合蛋白疫苗抗小鼠纤维肉瘤血管生成的实验研究

目的：利用Antigen43（Ag43）／成纤维细胞生长因子I型受体（FGFR一1）重组嵌合蛋白作为疫苗,了解其是否具有抑制小鼠肿瘤生长的作用,并初步探讨其作用机理。方法：40只BALB／c雌性小鼠接种MethA细胞后第7天,随机分为Ag43／FGFR．1蛋白免疫组（AF组）、A酗3蛋白免疫组（Ag43组）、FGFR—1蛋白免疫组（FGFR一1组）和生理盐水对照组（NS组）4组,每组10只,观察免疫治疗后的荷瘤小鼠肿瘤体积和生存曲线,分别用免疫组织化学方法检测肿瘤组织微血管密度（MVD）,免疫印迹（Western blot）方法检测抗自身FGFR—1的抗体,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测分泌抗自身FGFR-1抗体的B淋巴细胞的数量。结果：Ag43／FGFR-1组与FGFR-1蛋白、A甜3蛋白、生理盐水对照组肿瘤组织MVD计数分别为11．9±2．3、59．6±3．8、60．6±1．2和61．9±3．4（P〈0．01）;与对照组相比,Ag43／FGFR-1组肿瘤体积明显变小（P〈0．01）,存活时间明显延长（P〈0．01）,血清中发现含有抗自身FGFR-1的抗体且发现小鼠脾脏中分泌抗自身FGFR-1抗体的B淋巴细胞数目明显增多（P〈0．01）。结论：Ag43／FGFR-1蛋白质疫苗能够诱导荷瘤鼠产生特异性免疫反应,从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤的生长。     

肼对大鼠心肌成纤维细胞增殖和凋亡影响的实验研究

目的:不同浓度的肼处理体外培养的心肌成纤维细胞,观察其增殖和凋亡情况。方法:用MTT法检测对细胞增殖的影响;光学倒置相差显微镜和Hochest33258荧光染色观察细胞处理前后的形态学变化,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率。结果:MTT检测显示细胞增殖受到抑制;荧光染色后观察到明显的细胞凋亡的核浓缩、核聚集形态;流式细胞仪检测显示细胞凋亡率和坏死率与对照组比较差异均有显著性。结论:肼可抑制心肌成纤维细胞增殖,其作用随浓度增加而加强,低浓度(2mmol·L-1以下)的肼可导致心肌成纤维细胞凋亡,浓度大于2mmol·L-1则导致细胞坏死。     

肝X受体激动剂T0901317对TGF-β1诱导人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白表达的影响

目的 探讨肝X受体激动剂T0901317对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响.方法 组织块贴壁法培养人正常肺成纤维细胞,波形蛋白和角蛋白免疫组织化学鉴定.T0901317及 TGF-β1刺激人正常肺成纤维细胞后,分别应用Western blot 和激光共聚焦显微镜观察FN的表达.结果 成纤维细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白.Western blot和免疫荧光结果均显示正常肺成纤维细胞基态下表达较多的FN,TGF-β1可以诱导FN表达的进一步上调,而T0901317在5 μg/mL时即可抑制这种表达的上调.结论 肝X受体激动剂T0901317可以抑制TGF-β1诱导的体外人正常肺成纤维细胞FN表达的上调,可能具有潜在抗纤维化治疗作用.     

Ag43/FGFR1嵌合蛋白疫苗诱导小鼠产生特异性抗体的研究

目的 了解Antigen43/成纤维细胞生长因子1型受体(Ag43/FGFR1)重组嵌合蛋白作为疫苗能否诱导小鼠产生抗自身FGFR1抗体.方法 利用重组的Ag43/FGFR1嵌合蛋白作为疫苗免疫BALB/c小鼠,分别用Westernblot、酶联免疫吸附实验(ELISA)和酶联免疫斑点实验(ELISPOT)方法检测小鼠血清中产生的抗体及其亚型和脾脏中分泌抗FGFR1抗体的特异B淋巴细胞情况.结果 Western blot和ELISA检测发现,Ag43/FGFR1蛋白免疫组可以有效诱导产生抗自身FGFR1抗体,而小鼠FGFR1自身蛋白对照组、Ag43蛋白对照组、生理盐水对照组均未发现抗自身FGFR1抗体.ELISPOT检测发现,与各对照组相比,Ag43/FGFR1蛋白免疫组分泌抗自身FGFR1抗体的B淋巴细胞数目明显增多(均P<0.01).ELISA检测发现主要抗体亚型IgG1和IgG2b明显升高.结论 Ag43/FGFR1重组嵌合蛋白质疫苗免疫小鼠能够诱导产生抗小鼠FGFR1的自身抗体,可以考虑应用于抗肿瘤血管生成研究.     

肝X受体激动剂T0901317抑制TGF-β1诱导的人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白的表达

[摘要] 目的 探讨肝X受体激动剂T0901317对TGFβ1诱导的人正常肺成纤维细胞纤维连接蛋白（fibronectin, FN）表达的影响。方法 组织块贴壁法培养人正常肺成纤维细胞,波形蛋白和角蛋白免疫组织化学鉴定。T0901317及 TGF-β1刺激人正常肺成纤维细胞后,分别应用Westernblot 和激光共聚焦显微镜观察FN的表达。结果 成纤维细胞表达波形蛋白不表达角蛋白。Westernblot ,免疫荧光结果均显示正常肺成纤维细胞基态下表达较多的FN,TGF-β1可以诱导FN表达的进一步上调,而T0901317 5μg/mL时即可以抑制这种表达的上调。结论 肝X受体激动剂T0901317可以抑制TGF-β1诱导的体外人正常肺成纤维细胞FN表达的上调,可能具有潜在抗纤维化治疗作用。     

FasL基因转染诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨Fas配体(Fas ligand,FasL)在大鼠肾移植免疫耐受中的作用及意义.方法:首先建立大鼠同种肾移植模型.实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒Ad-FasL的肾脏冷保存液经肾动脉灌注;建立同种大鼠肾移植模型.分别观察电镜、免疫组织化学法、肾功能测定、生存期,比较各组间的不同.结果:Ad-FasL治疗组肾移植受体大鼠平均存活天数为31.3 d,与对照组的平均9.1 d存活时间比较,平均存活天数增加了22 d,差异显著.Ad-FasL治疗组的移植肾功能基本保持稳定,对照组在术后5 d切除对侧肾脏后血清肌酐浓度迅速上升.结论:腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转染,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞的免疫细胞化学研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)转染体外培养的人表皮细胞后细胞表型的变化. 方法:通过脂质体(Lipofectamine TM2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,36h后采用免疫细胞化学染色法检测分析β1整联蛋白、CK19、CK14及CK10在表皮细胞中表达的变化,同时以pEGFP-C3质粒转染的表皮细胞作为对照. 结果:实验组细胞中CK19、CK14的表达增强, 而CK10作为终末分化细胞的标志表达减弱. 结论:pEGFP-C3-bFGF转染后,分化成熟的表皮细胞向幼稚型细胞方向发生去分化,为探讨 bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

阿托伐他汀对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞分化的影响

【目的】观察阿托伐他汀对肺纤维化大鼠的肺成纤维细胞增殖的影响及其对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞表型分化的影响。【方法】建立Wistar大鼠肺纤维化模型,1周后取肺组织进行成纤维细胞原代培养,细胞经鉴定后以不同浓度的阿托伐他汀对试验组细胞进行干预,采用MTT法测定细胞增殖情况;TGF-β1诱导细胞分化,同时给予不同浓度阿托伐他汀干预,免疫细胞化学染色（SP）法检测药物对肌成纤维标志物-αSMA表达的影响。【结果】MTT结果显示：各剂量组中不同干预天数所测得的OD值之间存在显著差异（P〈0.01）。各时间点所测OD值与不同用药物剂量之间存在交互作用（P〈0.01）。各剂量组对细胞的抑制作用之间存在显著差别（P〈0.01）。免疫细胞化学染色结果显示：药物因素对-αSMA的表达量有影响（P〈0.01）,区组因素对-αSMA的表达量有影响（P〈0.01）。【结论】阿托伐他汀可抑制肺纤维化大鼠肺成纤维细胞的增殖,同时可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的分化,这主要表现在抑制细胞增殖、改变其形态、减少肌成纤维细胞的标志性产物-αSMA的产生上。     

成纤维细胞介导的人IL-10基因疗法的实验研究

目的：建立ＩＬ－１０基因疗法的实验模型，并动态观察其体内ＩＬ－１０分泌水平。方法和结果：构建携带鼠ＩＬ－１０基因的重组逆转录病毒载体，体外转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，筛选到１株高分泌ＩＬ－１０的细胞克隆株；将此阳性克隆株移植到小鼠腹腔内，可在小鼠血清中检测出ＩＬ－１０的活性。结论：成纤维细胞能成功地将ＩＬ－１０基因导入体内并有效表达     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响

目的 构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用.方法 构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化.结果 沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度.结论 pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用.