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目的分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床分离株热休克蛋白60基因编码区序列特征。方法对分离自我国不同地区、患有不同胃肠疾病患者的63株Hp提取基因组DNA并设计hsp60特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增hsp60基因,经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化PCR产物并测序,用DNAstar 5.0软件中的Clustal W程序对hsp60基因序列及由该序列翻译的氨基酸序列进行比较分析。结果成功特异性扩增并纯化到hsp60全基因序列。经序列比对,发现不同胃肠疾病来源的hsp60基因核苷酸序列在877、1 399以及1 579位点处存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。其中来源于非胃癌患者的Hp在以上三位点处分别有8株(8/48,16.67%)G→A置换,9株(9/48,18.75%)C→G置换,7株(7/48,14.58%)A→G置换;胃癌患者来源的Hp在以上三位点处分别有3株(3/18,16.67%)G→A置换,1株(1/18,5.55%)C→G置换,2株(2/18,11.11%)A→G置换。将核苷酸序列翻译为氨基酸序列后,在以上三位点所对应的氨基酸序列,即293、467以及527位点处分别发生了由缬氨酸(V)到异亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及苏氨酸(T)到丙氨酸(A)的改变。结论我国Hp临床分离株热休克蛋白60基因序列存在单核苷酸多态性位点。 相似文献
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幽门螺杆菌热休克蛋白的致病机理研究 总被引:1,自引:0,他引:1
幽门螺杆菌(H.pylori)与胃部疾患关系密切并可能与许多胃外疾病有关。热休克蛋白(HSP)是一类广泛分布于生物界、具有高度保守性的蛋白。H.pylori能产生多种HSP。本文就H.pylori表达的HSP的致病机理作一简要综述。 相似文献
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幽门螺杆菌(H.pylori)与胃部疾患关系密切并可能与许多胃外疾病有关。热休克蛋白(HSP)是一类广泛分布于生物界、具有高度保守性的蛋白。H.pylori能产生多种HSP。本就H.pylori表达的HSP的致病机理作一简要综述。 相似文献
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目的观察重组热休克蛋白60(hsp60)对U937细胞分泌细胞因子IL-6的影响。方法对幽门螺杆菌标准株26695的基因进行定点突变,利用重叠延伸PCR法使1398和1399位点的AG突变为GC,获得重组hsp60基因片段并构建原核表达质粒pEASY-E1-rhsp60,经IPTG诱导在大肠杆菌表达突变型rhsp60,将50、100、200μg/mL的rhsp60(rhsp60组)、hsp60(hsp60组)分别与U937细胞共培养,于12、18、24h收集上清液,ELISA法检测上清中细胞因子IL-6水平,设PBS对照组。结果rhsp60组、hsp60组IL-6分泌水平均明显高于对照组(P均〈0.05),且同时点同浓度下rhsp60组IL-6分泌水平明显高于hsp60组(P均〈0.05),IL-6的分泌随着蛋白刺激浓度的升高而增高。结论rhsp60与hsp60皆可促进U937细胞分泌IL-6,胃癌来源的rhsp60使IL-6分泌量更多。 相似文献
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[目的]探讨隆起糜烂性胃炎(Raised Erosive Gastritis,REG)中医证型与幽门螺杆菌(Hp)感染和病理组织学及热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70)表达的关系,以期指导中西医结合防治REG。[方法]选择131例REG患者按中医辨证分为脾胃湿热证32例(Hp阳性19例,阴性13例),脾胃气虚证52例(Hp阳性者34例,阴性18例),脾虚湿热证47例(Hp阳性者33例,阴性14例)。所有受试者均行胃镜检查,取胃窦部活检标本行快速尿素酶试验及组织染色法检测Hp;病理组织学检查及免疫组织化学检测HSP60,其中63例免疫组织化学检测HSP70。并设正常对照(正常)组18例。[结果]REG脾虚湿热证组的萎缩、肠化生(IM)程度均高于脾胃湿热证及脾胃气虚证组(P0.05),而后2组之间比较以及3组中Hp阳性者与阴性者比较差异均无统计学意义(P0.05)。3组HSP60表达均较正常组增加(P0.01),而3组之间比较均P0.05;脾胃湿热证及脾虚湿热证组中Hp阳性者的HSP60表达均高于Hp阴性者(P0.05),而脾胃气虚组中的Hp阳性与Hp阴性者比较P0.05。3组的HSP70表达均较正常组增加(P0.01);而3组的HSP70阳性表达情况分别比较均P0.05;脾胃湿热证组中Hp阴性的HSP70表达高于Hp阳性者(P0.05),而脾胃气虚证组与脾虚湿热证组中Hp阳性者与阴性者HSP70表达比较均P0.05。REG Hp阳性者胃黏膜HSP60的表达明显高于Hp阴性(P0.01);REG Hp阳性者胃黏膜HSP70的表达与Hp阴性者比较P0.05。[结论]REG脾虚湿热证患者胃黏膜萎缩、IM程度均高于脾胃气虚证及脾胃湿热证。REG3组胃黏膜HSP60及HSP70的表达均较正常组增强。Hp感染可诱导胃黏膜HSP60的高表达。HSP60表达既与Hp感染有关,又与湿热之邪有关。 相似文献
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血清中幽门螺杆菌热休克蛋白抗体与胃炎性病变的相关性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 对血清中幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白 (HSP)B抗体 (IgG)的滴度与胃黏膜病理变化之间的关系进行研究 ,以探讨HSPB抗体在Hp相关性疾病中的作用。 方法 从山东胃癌高发区随机取样 10 36例 ,其中Hp阳性者 6 0 0例 ,选取 30 0例行Hp三联根治治疗。第 5年复查胃镜并留血标本 ,随机抽取诊断为Hp阴性慢性浅表性胃炎 ,Hp阳性慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡各 2 0例 ,用Westernblot法对患者血中Hp的HSPB抗体滴度进行比较。 结果 Hp阳性慢性浅表性胃炎患者的抗体滴度 (0 .5 0 5± 0 .0 6 1)高于Hp阳性萎缩性胃炎 (0 .4 4 8± 0 .10 5 ,P <0 .0 5 )及消化性溃疡(0 .4 4 7± 0 .10 9,P <0 .0 5 ) ,Hp阴性慢性浅表性胃炎的HSP抗体滴度最低。结论 血清中的HpHSPB抗体对于胃黏膜炎症的加重可能具有一定的保护作用 相似文献
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背景:幽门螺杆菌(h.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌,以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗己成为探索新型H.pylori疫苗的重要途径。目的:构建携带H.pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法:应用基因工程技术将1640bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定,并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析,再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果:重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切,证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A—hspB,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A—hspB中所含的H.pylori-hspB与基因文库中量H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97%。结论:成功构建并鉴定了携带量H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。 相似文献
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
新近研究表明:幽门螺杆菌(Hp)的尿素酶B亚单位(UreB)、热休克蛋白A亚单位(HspA)和空泡细胞毒素(VacA)均是有效的抗原成分。由于Hp属微需氧菌,培养条件要求高,难以获得大量天然来源的UreB,HspA,VacA等成分。我们运用PCR技术克隆HphspA基因,并构建载体对其进行序列分析。材料与方法一、材料质粒PinPointTMXa3购自Promega公司。大肠杆菌JM109及Hp菌株系本室保存菌种。EcoRV、HindⅢ(宝灵曼公司),T4连接酶,TaqDNA聚合酶和PCR分子量标准(华美生物工程公司)。… 相似文献
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幽门螺杆菌疫苗的研究进展 总被引:7,自引:0,他引:7
摘要幽门螺杆菌(H.pylori)是人类上消化道疾病的重要致病菌,为慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要病因。目前临床治疗尚存在诸多不足,研制疫苗对预防和控制H.pylori感染具有十分重要的意义。经过20余年的发展,H.pylori疫苗在动物模型建立、候选抗原的选择、佐剂和投递方式的优化等方面均已取得了较大突破。本文主要就全菌疫苗、亚单位疫苗(基因工程疫苗)、活载体疫苗和DNA疫苗四种类型的H.pylori疫苗的研究现状作一概述。 相似文献
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背景:细胞因子具有免疫佐剂效应,但将其用作幽门螺杆菌(H.pylori)核酸疫苗佐剂的研究报道尚少。目的:构建同时含H.pylori尿素酶B亚单位(ureB)基因和小鼠白细胞介素-2(IL-2)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,体外鉴定其表达蛋白的免疫原性,体内检测其对H.priori感染的免疫保护作用。方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增H.priori ureB基因和小鼠IL-2基因,分别插入pUCmT载体,测序,通过一系列酶切、连接反应分别克隆人真核表达载体pIRES,酶切、PCR鉴定;重组质粒pIRES-ureB和pIRES-ureB-IL-2分别转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,进一步转化终宿主菌SL7207,反复传代培养。以Lipofectamine^TM2000将重组质粒分别体外转染COS-7细胞,蛋白质印迹法检测表达蛋白的免疫原性。以疫苗菌经口接种小鼠,4周后予H.pylori攻击,攻击后4周鉴定H.pylori感染状况。结果:测序结果显示扩增出的ureB和IL-2基因序列与GenBank中的H.pylori ureB和小鼠IL-2序列一致,酶切、PCR鉴定证实ureB和IL-2基因已克隆人pIRES载体,并成功构建了稳定的含H.pylori ureB和小鼠IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。蛋白质印迹法显示,pIRES-ureB-IL-2转染的COS-7细胞表达特异性UreB和IL-2蛋白。体内实验显示,疫苗接种组小鼠的免疫保护率显著高于PBS对照组(P〈0.01),其中ureB-IL-2疫苗组又显著高于ureB疫苗组(87.5%对62.5%,P〈0.05)。结论:成功构建了编码H.pylori ureB和免疫佐剂IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,体外实验证实其可表达具有免疫原性的抗原蛋白和佐剂蛋白,体内实验证实其对小鼠H.pylori感染具有免疫保护性,免疫佐剂IL-2可提高核酸疫苗的免疫保护率。 相似文献
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外膜蛋白疫苗对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用 总被引:9,自引:0,他引:9
研究幽门螺杆菌(H.pylori)外膜蛋白(OMP)加大肠杆菌不耐热内毒素(LT)经口免疫对小鼠H.pylori感染的保护作用。探讨定量细菌培养在疫苗免疫效果评价中的应用。方法从H.pyloriNCTC11637菌株制备OMP和全菌超声粉碎抗原,LT作为粘膜免疫佐剂。通过灌胃分别以H.pylori全菌超声粉碎抗原1mg加LT10μg(A组)、H.pyloriOMP0.5mg加LT10μg(B组)和生理盐水(C组)免疫小鼠(n=30),每周1次,共4次。免疫完成后4周以H.pyloriSydneyStrain1菌株攻击小鼠1次(1×107CFU/只),攻击后4周处死小鼠,取胃分别作快速尿素酶试验、病理检查及定量细菌培养,观察H.pylori定植情况。结果C组小鼠Hpylori定植密度为2.40×107CFU/g胃组织,A组和B组小鼠分别为2.03×105CFU/g和6.76×105CFU/g胃组织,免疫组的定植密度明显降低。结论口服HpyloriOMP加LT对小鼠H.pylori感染具有一定免疫保护作用,但不能完全预防感染,需进一步筛选更为有效的抗原和佐剂。定量细菌培养可以更敏感、更客观地反映胃粘膜H.pylori定植量和评价疫苗免疫效果。 相似文献
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幽门螺杆菌27kDa外膜蛋白的基因克隆和特性鉴定 总被引:17,自引:1,他引:16
背景:幽门螺杆菌(H.pylori)是全球人群中感染范围最广的致病菌,现已被公认为慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因子,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的形成密切相关。而H.pylori疫苗可能成为控制这一全球范围感染的有效措施。其研制和开发已成为目前研究热点。目的:探索研制H.pylori疫苗的新途径,对H.pylori27kDa外膜蛋白(OMP27)进行基因克隆和特性鉴定。方法:培养和收集H.pylori菌株NCTC11637,采用酚;氯仿抽提和纯化基因组DNA。分别设计引物P1和P2,并以该基因组DNA为模板,以聚合酶链反应(PCR)方法扩增OMP27基因片段。构建pQE30-OMP27重组表达载体时,pQE30质粒载体和纯化的PCR产物均用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切,再用T4DNA连接酶将双酶切后的目的基因片段OMP27重组于pQE30的相应酶切位点之间,连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue。挑选转化克隆,提取质粒,并进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切和PCR方法鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切和PCR扩增结果,经测序分析确认后,筛选出插入目的基因的阳性克隆,命名为pQE30-OMP27,挑取单个含重组质粒pQE30-OMP27的工程菌(XL1-Blue)阳性克隆,进行培养和IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot进行蛋白表达和抗原性鉴定。结果:该目的基因的PCR产物全长723bp。编码241个氨基酸残基组成的多肽(约27kDa)。SDS-PAGE和Western blot检测表明,电泳图谱上显示出1条相对分子量约27kDa的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与H.pylori感染小鼠血清发生特异性反应,表明重组H.pyloriOMP27具有良好的抗原性。结论:H.pyloriOMP27有望成为新的H.pylori疫苗候选分子,并可作为抗原用于H.pylori感染患者血清膜蛋白抗体的检测。 相似文献
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肠化胃黏膜病变组织HSP60的表达与幽门螺杆菌感染的相关性 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨HSP60在肠化胃黏膜组织中的表达及与H pylori感染之间的关系.方法:对171例肠化胃黏膜组织其中I型肠化54例、Ⅱ型肠化76例、Ⅲ型肠化41例,对照组浅表性胃炎40例,胃癌49例,采用SP免疫组织化学技术进行胃黏膜HSP60的检测,用ELISA,H pylori IgG抗体检测及H pylori-DNA PCR方法进行H pylori感染情况的判定.结果:HSP60在肠化胃黏膜组织中的表达主要为中等强度阳性,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型肠化胃黏膜组织的阳性率分别为35.19%,51.32%,75.61%,过表达率分别为1.9%,3.9%和19.5%;浅表性胃炎组织中的表达多为弱阳性或中等强度阳性,阳性表达率为30.00%,与浅表性胃炎相比肠化胃黏膜组织中HSP60的表达显著增加(P<0.01);HSP60在胃癌组织的表达以强阳性和中等强度阳性为主,阳性表达率为73.47%,过表达率为34.69%,明显高于Ⅰ,Ⅱ型肠化胃黏膜组织中的表达,与Ⅲ型肠化胃黏膜组织相比差异不显著(P>0.05),肠化胃黏膜组织的Hpylori感染和HSP60表达有明显的相关性(r=-0.191,P=0.012)结论:HSP60的过度表达发生在胃黏膜病变的进展过程中;肠化胃黏膜组织中H pylori感染和HSP60表达有明显的相关性. 相似文献
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携带幽门螺杆菌hpaA基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
构建携带幽门螺杆菌(H.pylori)hpaA基因的重组活减毒鼠伤沙门疫苗菌。方法:用分子生物学方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行核苷酸测序,重组质粒经再导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,提取重组菌苗质粒,聚合酶链反应(PCR)和酶切鉴定,筛选目的克隆。结果:经PCR和酶切证实,构建了携带hpaA基因(560bp)的重组核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结论:S我建并鉴定了携带H.pylorihpaA基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为探索制备H.ylori口服份活疫苗奠定了基础。 相似文献
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热休克蛋白72重组腺病毒包装及其对细胞凋亡的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 包装热休克蛋白72重组腺病毒表达载体,探讨其对ECV304细胞凋亡的影响.方法采用细菌同源重组法构建了热休克蛋白72重组腺病毒表达载体;流式细胞仪检测重组腺病毒对细胞凋亡的影响;荧光报告系统和蛋白印迹分析重组腺病毒对p53转录的调节和蛋白表达的影响.结果 成功包装了热休克蛋白72重组腺病毒,热休克蛋白72能够促进细胞凋亡,从转录水平上调p53蛋白的表达.结论 热休克蛋白72可能通过上调p53蛋白的表达促进细胞凋亡. 相似文献
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幽门螺杆菌hpaA核酸疫苗的构建及免疫原性检测 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因的核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增hpaA基因,克隆入pUCmT载体,检测hpaA基因序列,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体plRES,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-hpaA转染COS-7细胞,SDS-PAGE及Western印迹法检测pIRES-hpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果 成功扩增出长约750bp的hpaA基因.测序结果表明扩增出的hpaA基因与Hp hpaA序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES,成功构建了含hpaA基因的Hp核酸疫苗pIRES-hpaA,并经Western印迹法检测到特异性蛋白条带。结论 构建了hpaA基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础。 相似文献