密骨颗粒对成骨样细胞增殖及IGF-I活性影响的实验研究

依据中医"肾主骨"的理论,通过运用中药血清药理学和建立成骨样细胞(UMR106)体外培养模型,采用MTT法和EIA法,检测补肾中药密骨颗粒含药血清对成骨样细胞增殖和IGF-I的活性,阐明补肾中药对肾虚骨质疏松症的防治机理.结果表明密骨颗粒含药血清组的成骨样细胞数目和IGF-I的活性明显高于正常组(P均＜0.05);密骨颗粒与骨疏康颗粒含药血清之间IGF-I活性无明显差别(P＞0.05);密骨颗粒与骨疏康颗粒含药血清都有促进体外培养成骨样细胞的增殖和IGF-I的活性的作用,而且呈剂量依赖性.从而为"肾主骨"、"气能生精"的理论提示出客观化、科学化依据;密骨颗粒含药血清可以促进成骨样细胞的增殖和IGF-I的活性,而达到防治肾虚骨质疏松症的目的.     

少阳生骨方含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨少阳生骨方对BMSCs成骨分化的影响,并初步探究其可能的作用机制。方法:以不同浓度少阳生骨方含药血清(0.035、0.07、0.14、0.28、0.56 g/mL)干预BMSCs,MTT法检测细胞增殖。将BMSCs分为少阳生骨方含药血清组(含药血清组)、对照组(无药血清组)、经典诱导组(阳性对照),碱性磷酸酶染色测定成骨活性,茜素红染色鉴定矿化结节形成,免疫组化检测各组中BMP-2、Runx2蛋白表达水平。结果:0.28、0.56 g/kg灌胃少阳生骨方含药血清对BMSCs有显著的促增殖作用(P0.05),少阳生骨方含药血清诱导7、14天能显著增加BMSCs碱性磷酸酶活性、矿化结节数及成骨相关蛋白BMP-2、Runx2阳性表达(P0.05)。结论:少阳生骨方能诱导BMSCs成骨分化,其机制可能与上调BMP-2、Runx2蛋白的表达有关。     

复方中药含药血清对大鼠成骨细胞增殖及矿化功能的影响

目的：观察补肾健脾活血方中药含药血清对大鼠成骨细胞增殖及矿化功能的影响。方法：制备补肾健脾活血方复方中药含药血清，取不同浓度剂量干预体外培养的成骨细胞，用MTT法检测成骨细胞增殖率，用茜素红染色法显示矿化结节的形成。结果：补肾健脾活血方含药血清能明显增加成骨细胞增殖率和矿化结节形成数，且与含药血清浓度呈正相关。结论：补肾健脾活血方能明显促进成骨细胞的增殖，并能促进成骨细胞对骨机质的矿化功能。     

清络通痹颗粒含药血清对体外培养的成骨细胞和破骨细胞的影响

目的：观察清络通痹颗粒（QLTBG）含药血清对体外培养的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶（AKP）活性及破骨细胞增殖的影响。方法：（1）取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞，取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养破骨细胞。（2）MTT法检测成骨细胞、破骨细胞增殖，偶联重氮盐法测定成骨细胞AKP活性。结果：QLT以7．2，14．4g／kg给药的大鼠含药血清对成骨细胞的增殖能力有明显增强作用，能明显增加AKP活性；QLT以3．6，7．2，14．4g／kg给药的大鼠含药血清对破骨细胞均有明显的抑制作用。结论：清络通痹颗粒含药血清可促进成骨细胞增殖、增强成骨细胞的AKP活性，抑制破骨细胞增殖。     

强骨宝方糖尿病模型鼠不同时效与量效的含药血清对成骨细胞增殖的影响

目的：探讨强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清促进体外培养成骨细胞增殖的最佳时相与量效。方法：采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1—2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出成骨细胞，鉴定细胞后，用不灭活的不同时效（灌胃3d、5d，末次灌胃后1h、3h）、不同浓度（5％、10％、20％）的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清加入成骨细胞培养体系，培养镐、72h，应用MTT比色法来检测其对成骨细胞增殖功能的影响。结果：各时相的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清对成骨细胞的增殖作用呈浓度依赖性，即20％〉10％〉5％；其中以3d末次灌胃后1h、20％的含药血清作用最明显，在成骨细胞培养48h、72h后均具有显著促进其增殖作用。结论：灌胃3d、末次灌胃后1h、20％不灭活的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清对成骨细胞增殖作用最明显。     

清热解毒方对血管内皮细胞增殖的影响

目的：探讨清热解毒方药对血管内皮细胞增殖的影响。方法：用内毒素造成血管内皮细胞损伤模型。再用含药血清与内毒素共同作用，用MTT法检测活细胞的数目，从而间接地反映方药对血管内皮细胞的增殖作用。结果：清热解毒方能拮抗内毒素对血管内皮细胞的损伤。结论：清热解毒方对血管内皮细胞有保护作用。     

滋肾健骨方含药血清对人骨髓间充质干细胞成骨分化中TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的 探讨滋肾健骨方含药血清对老年骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其作用机制。方法 取SD大鼠制备低、中、高剂量滋肾健骨方含药血清和空白血清。将培养第3代的老年骨质疏松症患者hBMSCs分为6组，空白组常规培养；模型组进行成骨诱导；空白血清组进行成骨诱导+空白血清培养；低剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+低剂量滋肾健骨方含药血清培养；中剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+中剂量滋肾健骨方含药血清培养；高剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+高剂量滋肾健骨方含药血清培养。CKK-8法检测细胞增殖情况，碱性磷酸酶(ALP)染色观察细胞分化情况，Western blot法检测细胞中转化生长因子-β₁(TGF-β₁)、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达情况。结果 与模型组和空白血清组比较，各剂量滋肾健骨含药血清组细胞增殖活性和ALP活性均明显增强(P均<0.05),且中、高剂量滋肾健骨含药血清组均明显强于低剂量滋肾健骨含药血清组(P均<0.05);与模型组和空白血清组比较，各剂量滋肾健骨含药血清组细胞...     

菟丝子含药血清对成骨细胞代谢调控的影响

目的探讨菟丝子含药血清对体外培养大鼠成骨细胞代谢调控的影响。方法采用血清药理学方法制备菟丝子含药血清;采用改良的组织块法体外培养大鼠成骨细胞;分别用5%、10%、15%、20%菟丝子含药血清诱导培养成骨细胞24h、48h、72h后,MTT法检测大鼠成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)的活性;培养48h后用RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)mRNA的表达。结果 5%和10%菟丝子含药血清在48h和72h能显著促进成骨细胞增殖并提高ALP活性;在48h时10%菟丝子含药血清可促进COL-ⅠmRNA的表达。结论 10%菟丝子含药血清能够明显促进大鼠成骨细胞的增殖与分化,表明其具有促进成骨作用。     

制何首乌对成骨细胞的作用及其作用机理的研究

目的:探讨制何首乌单味药含药血清对成骨细胞(Ob)功能的影响,并探讨其作用机理。方法:通过血清药理学制备制何首乌单味药含药血清,采用SD新生大鼠头盖骨分离诱导成成骨细胞,应用CCK-8法、碱性磷酸酶(ALP)法,检测制何首乌含药血清对Ob增殖和分化的功能,同时通过RT-PCR方法检测含药血清对Ob成骨相关基因表达的影响。结果:制何首乌含药血清能促进Ob增殖,浓度10%、20%、30%促增殖作用显著(P<0.01),组间无浓度相关性;5%和10%的含药血清能下调翻译后水平ALP,但高浓度无此作用。同时,制何首乌含药血清上调成骨相关基因(OC、ALP、Cbfα1)mRNA表达(P<0.05)。结论:制何首乌单味药含药血清具有刺激体外培养Ob的增殖作用,其作用机理可能与上调Ob成骨相关基因的表达有关。     

补肾健脾活血方对大鼠成骨细胞增殖的影响

目的:观察补肾健脾活血方中药含药血清对大鼠成骨细胞增殖的影响.方法:制备补肾健脾活血方中药含药血清,取不同浓度剂量干预体外培养的成骨细胞,用MTT检测成骨细胞增殖率.结果:补肾健脾活血方含药血清能明显增加成骨细胞增殖率形成,且与含药血清浓度呈正相关.结论:补肾健脾活血方能明显促进成骨细胞的增殖,并能促进成骨细胞对骨机质的功能.     

中药血清对体外培养脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的观察中药对内皮细胞增殖的抑制作用.方法制备含中药的大鼠血清,将其加入到培养的内皮细胞中,应用流式细胞仪观察细胞增殖与凋亡的情况.结果含中药血清对内皮细胞周期有明显影响,可使内皮细胞周期中G2-M期细胞比例减少,S期细胞相对增加,说明中药可阻滞内皮细胞由S期进入G2-M期,从而降低其有丝分裂能力,并可诱导内皮细胞凋亡.结论中药对内皮细胞的增殖有抑制作用,为临床治疗视网膜血管增生性病变提供实验依据.     

复方丹参注射液对受损伤的血管内皮细胞形态结构的影响

目的探讨复方丹参注射液对氧化所致损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法采用脐静脉血管内皮细胞(hum anumb ilical ve in cells),用倒置相差显微镜和扫描电镜观察各组内皮细胞(endothelial cell,EC)的形态学特点。分光光度计测定细胞上清液中丙二醛的含量。结果扫描电镜观察显示过氧化氢组EC皱缩变小,细胞表面干裂,表面微绒毛减少甚至消失,细胞间隙增宽,而经丹参预处理过的过氧化氢组细胞形态结构则明显改善。MDA含量测定表明过氧化氢组的MDA含量明显增高。相反,正常组和丹参组中MDA含量减少(P<0.01)。结论复方丹参注射液通过其抗氧化作用,对氧化所引起的受损血管EC有保护作用。     

山莨菪碱对血管内皮细胞组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响及其机制研究

目的 通过研究山莨菪碱对内毒素脂多糖(LPS)致血管内皮细胞组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI—1)表达的影响,探讨山莨菪碱治疗感染性休克的机制。方法 用酶消化法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC);ELISA方法检测HUVEC条件培养液PAI—1蛋白量：用一步凝固法检测HUVEC TF活性;Northern blot检测HUVEC TF和PAI—1的mRNA表达;为了评估上述作用是否通过NF—κB途径而转导,用电泳迁移变动检测法(EMSA)检测HUVEC核提取物NF—κB DNA结合活性。结果 LPS能使HUVEC PAI—1蛋白和TF活性及其mRNA表达显著增强,加入山莨菪碱后,LPS的这种作用明显减弱,并与山莨菪碱呈量效关系。山莨菪碱能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF—κB DNA结合活性。结论 山莨菪碱治疗感染性休克的机制之一可能是通过拮抗LPS致HUVEC TF和PAI—1的表达。而且这种拮抗作用可能通过NF—κB途径来转导。     

中药芪红合剂含药血清对人外周血内皮祖细胞增殖的影响

目的观察中药芪红合剂含药血清对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响。方法将12只雄性Wistar大鼠随机分为中药芪红合剂组（低剂量组、中剂量组、高剂量组）和对照组,制备含药血清和空白血清。采用密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞,经激光共聚焦显微镜、流式细胞仪鉴定为EPCs。加入各实验血清组培养液培养EPCs,分别作用不同时间（24h、48h、72h）后,倒置相差显微镜下观察EPCs生长情况,噻唑蓝比色试验（MTT法）测定EPCs的吸光度值。结果与对照组比较,中药芪红合剂合药血清低、中、高剂量组EPCs增殖明显（P〈0．05）,且呈一定的量效、时效关系。在同一作用时间,低剂量芪红合剂含药血清干预后EPCs的增殖明显（P〈0．05）。在同一剂量组中,芪红合剂含药血清干预后EPCs的增殖随时间推移逐渐增强,于72h达到高峰（P〈0．05）。结论中药芪红合剂含药血清对体外培养的人外周血EPCs的增殖具有一定的促进作用,可能是其防治血管内皮损伤及内皮功能障碍相关性疾病的作用机制之一。     

Effects of quercetin on the release of endothelin, prostacyclin and tissue plasminogen activator from human endothelial cells in culture

Quercetin and related flavonoids are naturally occurring polyphenolic compounds with multiple pharmacological activities. Using cultured human umbilical vein endothelial cells, we investigated the effects of quercetin on endothelin (ET-1) and tissue plasminogen activator (t-PA) release induced by thrombin. We observed that when endothelial cells pretreated with 5 or 50 microM of quercetin were incubated for 4 and 24 h with thrombin, ET-1 concentration-dependently decreased (n = 6, P < 0.01, at 4 h IC50 = 1.54 microM, at 24 h IC50 = 2.78 microM). Under the same experimental conditions, quercetin significantly increased t-PA (n = 6, P < 0.01, at 4 h EC50 = 0.71 microM and at 24 hrs EC50 = 0.74 microM). In the same preparation, we evaluated prostacyclin (PGI2) release, induced by thrombin activated platelets, as determined by a 6-Keto-PGF1alpha radioimmunoassay. Following the treatment of cultured endothelial cells with activated platelets, the concentration of 6-Keto-PGF1alpha was significantly increased (P < 0.01). Quercetin (1, 5, and 20 microM) inhibited PGI2, in a concentration-dependent manner (n = 6, P < 0.05). Our data indicate that quercetin modulates the release of ET-1, t-PA, and PGI2 from vascular endothelial cells.     

天麻素对体外模拟脑缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的：观察中药天麻素对培养的正常及缺血大鼠脑微血管内皮细胞（BMEC）的影响，以探讨天麻素对BMEC的作用。方法：采用体外培养的BMEC，模拟脑缺血损伤，观察天麻素对其活性、生存率和一氧化氮（NO）的影响。结果：缺血损伤模型BMEC活性及生存率较正常对照组明显降低；不同剂量天麻素对正常对照组BMEC活性、生存率及NO含量有升高趋势；正常对照组不同剂量天麻素BMEC活性较缺血损伤模型组活性有明显升高（P〈0．05）；天麻素高剂量可明显提高缺血损伤BMECNO含量（P〈0．05）。结论：天麻素各实验剂量可增强缺血损伤BMEC活力，提高受损内皮细胞（EC）的生存率；促使ECNO分泌增加。提示天麻素对体外培养的大鼠BMEC缺血损伤具有一定的保护作用。     

通脉丸对人血管内皮祖细胞功能的影响

目的应用含通脉丸的培养基进行实验研究,探讨其对人内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）功能的影响。方法采用密度梯度离心法分离出人外周血EPCs,实验分为正常对照组、低剂量组（10mg/ml）、中剂量组（20mg/ml）和高剂量组（50mg/ml）,培养细胞7d。通过倒置显微镜、MTT实验以及细胞黏附、迁移实验评价EPCs增殖、黏附和迁移能力;采用细胞表型分析、VEGF的表达、NO的分泌和体外成血管能力来检测不同组别对细胞功能的影响。结果与对照组比较,不同浓度药物组能提高细胞的增殖、分化、迁移和黏附能力,并促进EPCs表型的改变、NO的分泌和VEGF的表达,形成丰富的血管样结构,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）;与低、高浓度组比较,中浓度组在细胞的增殖、黏附、迁移功能以及CD133表达和NO分泌等方面作用最为明显,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论通脉丸能明显改善外周血EPCs的功能,促使EPCs的增殖、分化、黏附和迁移,促进EPCs分泌NO和VEPF的表达,能够更快形成血管样结构。     

冠心平对H2O2致血管内皮细胞损伤的影响

目的：观察冠心平对H2O2致血管内皮细胞损伤过程中NOS与ET的影响。探讨冠心平治疗冠心病的可能机制。方法：体外培养内皮细胞ECV304,用100umol/L H2O2损伤细胞,随机分成正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、冠心平大、中、小剂量组。用血清药理学方法给药,继续培养后显微镜下观察细胞生长情况,检测NOS与ET。结果：100umol/L H2O2对ECV304有损伤作用。冠心平能显著提高NOS的活性;显著减少H202诱导ECV304ET的产生。结论：冠心平可降低H2O2对ECV304的损伤程度,其机理可能与其提高NOS活性,增加NO合成,并且减少ET的合成,从而调节血管舒缩功能有关。     

不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用

目的探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法制备（1）正常内皮细胞条件培养液（N—CM）：正常培养的内皮细胞不作任何处理;（2）正常用药内皮细胞条件培养液（NT—CM）：通络救脑注射液按1μl／ml浓度作用10h;（3）缺氧损伤内皮细胞条件培养液（I-CM）;（4）缺氧损伤用药内皮细胞条件培养液（IT—CM）：于损伤前4h,加入通络救脑注射液1μl／ml;分别作用于糖氧剥夺损伤的神经元模型,通过测定神经元线粒体活性、线粒体膜电位（MMP）及细胞色素C（CytC）,分析各个条件培养液对损伤神经元线粒体功能的影响。结果（1）与模型组比较,N—CM组与NT—CM组（P〈0．05）均可阻抑损伤神经元线粒体活性的下降,尤其是NT—CM保护作用更为明显。（2）与正常组比较,模型组MMP明显下降;I-CM使受损神经元的线粒体功能进一步下降;I-CM组可进一步降低受损神经元MMP,IT—CM可逆转神经元MMP下降,明显改善这种损伤状态。（3）N-CM组与NT—CM组均可降低损伤神经元的CytC释放,分别与模型组、I—CM组比较,差异均有显著性（P〈0．05）。结论脑微血管内皮细胞的旁分泌功能对损伤神经元的存活有重要的调节作用,该作用的实现可能与维持神经元线粒体功能有关,通络救脑注射液可促进该作用的发挥。     

淫羊藿苷对食管癌细胞EC9706增殖与凋亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)对食管癌细胞EC9706增殖的影响,明确其作用机制。方法:ICA(40,160,640 nmol·L^-1)作用EC9706细胞48 h后,应用CCK8法检测EC9706细胞增殖;应用Hoechest33342染色和荧光显微镜检测细胞凋亡;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax) mRNA表达;应用免疫印迹法检测Bax,Bcl-2的蛋白表达。结果:ICA能显著抑制EC9706细胞增殖;ICA作用EC9706细胞出现细胞凋亡形态学改变;免疫印迹结果显示Bax蛋白表达减少,而Bcl-2蛋白表达增多。结论:ICA能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖,其凋亡作用机制可能与上调Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白的表达相关。