聚合酶链反应技术用于诊断肺结核病的临床价值研究

应用聚合酶链反应技术扩增结核杆菌特异的４２０ｂｐＤＮＡ片段靶基因诊断结核病，并以培养法和涂片法作比较。共检测１４５份肺结核病的痰标本，阳性９１份，阳性率达６２．７６％，而培养法和涂片法阳性率仅分别为３８．６２％和１３．１％。但在５６份阳性标本中，有５份培养法和涂片法均为阳性的痰标本，而聚合酶链反应为阴性，假阴性率８．９２％。４２份健康人痰标本未见阳性扩增。     

地高辛标记布氏杆菌544ADNA探针的制备及其应用

作者应用自构键的ｐＢＣ_４重组质粒，经Ｋｐｎｌ和ＢａｍＨ_１双酶切回收０．２２ｋｂ的Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４ＡＤＮＡ片段，将此片段纯化后采用地高辛标记方法制备探针。点杂交结果表明：此探针检测布氏杆菌ＤＮＡ的灵敏度达５ｐｇ，对中国１９型布氏杆菌ＤＮＡ杂交出现强的杂交信号而对５种革兰氏阴性菌ＤＮＡ以及人白细胞ＤＮＡ没有产生杂交反应，具有特异性强、敏感性高、简便易行等特点。为进一步用于实验室诊断人、畜布氏杆菌病和流行病学的调查提供了有效的手段。     

都匀市亚洲牛带绦虫病感染危险因素分析

亚洲牛带绦虫（Taenia Saginata asiatica）的发现和命名是近30年来绦虫研究的新进展之一。中国学者近年来经过染色体细胞色素细胞氧化酶I（COI）基因特异性片段PCR扩增和序列分析。进行感染猪、牛的生物学、生化、病理及病原学等相关研究，均证实都匀牛带绦虫为亚洲牛带绦虫，但缺乏进行深入的流行原因调查。为此，本文对都匀亚洲牛带绦虫病人相关饮食卫生、膳食行为和习惯等因素进行调查，以期为亚洲牛带绦虫防治提供依据。     

PCR检测旋毛虫DNA的研究

根据旋毛虫幼虫１．６ｋｂ基因序列而设计合成引物并进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）以检测含旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电冰，可见扩增出了特异的６７０ｂｐ与５００ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而正常肌肉对照未见扩增出此条带。本法可检测０．０１条幼虫产物，具有高敏感性和特异性。     

杂交探针技术结合熔解曲线快速鉴别水痘一带状疱疹病毒野毒株／疫苗株

目的利用杂交探针结合熔解曲线分析技术,建立一种快速、可靠的适用于鉴别水痘一带状疱疹病毒（Varicella—zosterVirus,VZV）野毒株与疫苗株的方法。方法采集临床诊断为水痘患者的水疱液并进行病毒分离,抽提阳性分离物和部分阳性水疱液的基因组脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid,DNA）。以荧光素Cy5．5标记检测探针5端,相应的锚定探针在3端用FAM羧基荧光索标记,再从研究对象基因组DNA中用聚合酶链反应（PolymeraseChainReac—tion,PCR）特异引物扩增ORF62基因中301碱基对（basepair,bp）片段,将其与特异探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过罗氏LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度（MeltingTemperature,Tm）峰值对待测标本进行鉴别。最后,用限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）方法验证杂交探针结合熔解曲线鉴别野毒株／疫苗株的准确性。结果VZVOka疫苗株的扩增产物与检测探针的Tm为52．47℃,而水痘原始临床标本／临床分离株与检测探针的Tm在57．33℃～60．50℃。通过检测DNA扩增产物与VzVORF62探针Tm的差异可以明确鉴别VZV野毒株和疫苗株。利用杂交探针技术结合熔解曲线的方法对水痘原始临床标本及分离株进行野毒株／疫苗株的鉴别结果与传统的RFLP方法进行鉴别的结果完全一致。结论杂交探针技术结合熔解曲线操作简便省时,不易交叉污染;获得的病毒野毒株／疫苗株特征性强,适用于VZV野毒株／疫苗株在临床和流行病学调查中的快速鉴别诊断。     

鼠疫PCR技术的研究进展

多聚酶链式反应（ＰＣＲ），是近年发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。借助ＰＣＲ，可在几个小时内，将ＤＮＡ序列扩增２×１０５～２×１０６倍［１］。需要扩增的ＤＮＡ样品可以是纯净的，也可以是多种生物物质的异常复杂的混合物的一小部分，这种ＤＮＡ可以...     

苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究

目的探讨苏云金芽孢杆菌（Bt）与蜡状芽孢杆菌（Bc）的亲缘关系。为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR（ERIC-PCR）技术。对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增，对其指纹图谱进行分析；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致；所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外，以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系：500bD片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

美国THMP·TRONIC型PCR仪的性能及应用

美国ＴＨＭＰ·ＴＲＯＮＩＣ型ＰＣＲ仪的性能及应用浙江省义乌市人民医院设备科吕群随着现代生命科学技术的进步，多聚酶链式反应（简称ＰＣＲ）技术在近几年得到了很大发展．ＰＣＲ技术是一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术，其原理是在模板ＤＮＡ、引物和四种脱氧核糖苷...     

DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定

目的应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段,并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针. 方法采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段,然后用半抗原地高辛配基标记,在完成基因探针显色敏感度检测之后,应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试. 结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0.01 pg,具有白色念珠菌特异性,与其他念珠菌和细菌不发生杂交. 结论基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠,具有很强特异性,可应用于临床鉴定白色念珠菌感染.     

肠毒素大肠杆菌LTh－STIb二价基因探针的克隆及其应用研究

在肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）ＬＴｈ－ＳＴＩａ－ＳＴＩｂ三价基因探针的基础上，用限制性内切酶ＥｃｏＲｌ酶切，回收片段．重新构建ＬＴｈ－ＳＴＩｂ二价基因探针的克隆株。用辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ）直接标记二价基因探针，建立了增强型化学发光反应（ＥＣＬ）检测ＥＴＥＣ的方法．其敏感性可测到０．１ｐｇ的质粒ＤＮＡ或由１０个菌体培养而来的ＥＴＥＣ细胞，与同位素标记杂交方法的敏感性一致．且此探针仅与产ＳＴＩｂ、ＬＴｈ肠毒素的人源性ＥＴＥＣ菌株杂交，与ＳＴＩａ肠毒素菌株及其它非ＥＴＥＣ菌株均无杂交信号．该探针与三价探针及ＬＴｈ单价探针联合使用，能间接将ＬＴｈ、ＳＴＩａ和ＳＴＩｂ３种肠毒素分型。结果表明该方法简便快速、特异敏感，无放射性污染，是ＥＴＥＣ实验室诊断及分子流行病学调查的有效工具。     

石蜡包埋的石棉肺癌组织的基因组DNA的快速提取法

建立了从少量石蜡包埋的组织切片中快速提取石棉肺癌组织中的基因组ＤＮＡ的水煮脱蜡法，克服了传统的二甲苯脱蜡法的周期长、成本高和毒性大的缺点。所得到的基因组ＤＮＡ中，长片段占较大的比例，总量可足够用作１０～２０次ＰＣＲ扩增反应的模板，并可用于其它分子生物学研究     

应用压电基因传感器芯片检测结核分枝杆菌DNA

目的 由结核分枝杆菌引起的医院感染快速诊断问题已为越来越多的研究者所重视，压电基因传感器芯片技术主要依据晶体液相振荡理论，运用压电传感器与基因芯片技术结合，对标本中靶基因进行检测。方法 使用压电基因传感器芯片技术检测结核分枝杆菌ＤＮＡ。先以结核分枝杆菌ＤＮＡ探针结合在基因芯片表现，然后将１０６例结核患者标本ＤＮＡ分别与之杂交，将杂交信号通过数频处理器以频率变化值的形式输入电脑，再以专用分析软件进行结果分析。结果 检测阳性率为４２．５％，以ＰＣＲ扩增法及涂片法对相同标本进行检测，阳性率分别为３６．８％和１７．０％，同时对压电基因传感器芯片技术的特异性及灵敏度进行检测。结论 实验结果表明压电基因传感器芯片技术是一种比ＰＣＲ扩增法更简便、快速的结核分枝杆菌检测方法。     

中国人视黄醇结合蛋白cDNA的克隆与序列分析

目的：　为了进行中国人视黄醇结合蛋白（ｈｕｍ ａｎ ｒｅｔｉｎｏｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ, ｈＲＢＰ）的原核表达,克隆出ｈＲＢＰ的ｃＤＮＡ。　方法：　利用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法获得ｈＲＢＰ的ｃＤＮＡ,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体后,在美国ＡＢＩＤＮＡ 自动测序仪上以双脱氧法进行核苷酸序列测定。结果：　扩增出了约０．５８ｋｂ的特异片段,并筛选出阳性重组克隆质粒ｐＧＥＭ－ＲＢＰ,核苷酸序列测定表明其含有一段５８０ 个碱基的插入片段,与文献报道的一致。结论：　我们已获得了中国人ＲＢＰ的ｃＤＮＡ,可用于进行原核表达。     

生物素DNA探针/PCR系统用于班氏丝虫蚊媒监测的研究

目的：评价班氏丝虫特异生物素ＤＮＡ探针／ＰＣＲ系统用于丝虫病防治后期蚊媒监测的效果。方法;应用长臂光敏生物素标记的班氏丝虫种特异的ＤＮＡ片段（４９０ｂｐ）为探针,结合聚合酶链反应技术,对实验室感染蚊虫和现场捕获蚊虫进行检测。结果该探针只与班氏丝虫感染蚊提取的ＤＮＡ杂交,不与马来丝虫感染蚊提取的ＤＮＡ,其他动物丝虫ＤＮＡ以及正常蚊ＤＮＡ杂交。同批人工感染班氏微丝方虫,人工解剖人阳性率为２１．２８％,     

1例人感染带绦虫形态学及分子学鉴定

目的 对一例排绦虫节片患者进行驱虫治疗,对虫体进行形态学和分子学鉴定,确定其感染绦虫的种类。方法使用南瓜子-槟榔进行驱虫治疗。对驱出虫体进行形态学观察,采用聚合酶链式法（PCR）扩增虫体线粒体cox1基因片段,对PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和基因序列测序分析,然后与NCBI数据库中带绦虫cox1基因序列进行比对,同时利用MEGA 6.0软件构建系统进化树。结果 驱出8条长度230～520 cm不等近乎完整的带绦虫虫体,其中5条头节完整,形态学观察疑似亚洲带绦虫或牛带绦虫。PCR扩增cox1基因片段获得大小为1 620 bp的扩增产物,与NCBI数据库中亚洲带绦虫cox1基因（Gen Bank登录号为AB107235.1）同源性为99.58%。进化树分析表明与亚洲带绦虫的亲缘关系最近。结论 该病例属于亚洲带绦虫感染。     

CS2作业工人的精子X染色体非整倍体率

目的进一步探讨二硫化碳（ＣＳ２）对男性生殖系统的毒性。方法用生物素标记的α－卫星Ｘ染色体特异ＤＮＡ探针与接触ＣＳ２工人精子ＤＮＡ进行荧光原位杂交（ＦＩＳＨ），测定Ｘ染色体非整倍体率。结果厂空气中ＣＳ２平均浓度高于国家最高容许浓度１～３倍，ＣＳ２作业工人血睾酮（Ｔ）含量降低，间质细胞刺激素（ＦＳＨ）及黄体生成素（ＬＨ）含量升高；１１位工人总共计数６０３４４条Ｘ精子，Ｘ精子双体率为０．０８２％±０．０２２％，高于正常健康人的０．０６３％±０．０１３％，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论接触ＣＳ２男工妻子流产率增加可能与男工精子染色体非整倍体率增加有关。     

恶性疟原虫质粒DNA探针在蚊媒监测中的应用研究

利用克隆的质粒型ＤＮＡ片段用光敏生物素标记后作探针．以核酸分子杂交手段．检验蚊体内的恶性疟原虫．结果表明可从多种模拟感染蚊虫标本中特异地测出恶性疟原虫感染蚊。将一组蚊研磨后集体检测时，可测出２５只蚊虫中有１只感染者或含１００个子孢子的蚊虫，这极利于大样本的快速处理．而单个蚊虫直接任于硝酸纤维素膜上检测，更适于子孢子的精确估计。既能测新鲜蚊，又能测干燥蚊标本．     

RDPCR检测DNA损伤定位于核苷酸水平的研究

目的简化RDPCR建立程序,并在核酸序列水平精确定位DNA损伤。方法培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针。扩增k-ras基因外显子2(以下称短片段)。酶切短片段和基因组DNA构建损伤模型,前者经依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)扩增,每一步产物作凝胶电泳,终产物与单链探针杂交显色,并进行测序;后者以短片段建立的实验条件进行RDPCR扩增,产物与单链探针杂交显色,并进行测序。结果凝胶电泳可见酶切短片段在RDPCR中每一步骤的目的产物条带;酶切短片段和酶切基因组DNA的RDPCR产物均在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤均位于HinfI在k-ras外显子2上的酶切位点。结论短片段建立RDPCR的实验条件简单易行;并首次利用RDPCR检测DNA损伤精确定位于核酸序列水平的碱基位置。     

淡色库蚊和缺乏库蚊基因组多态性DNA的研究

本文应用随机引物扩增多态性ＤＮＡ聚合酶链反应技术（ＲＡＰＤ－ＰＣＲ）筛选出３种引物，对淡色库蚊，致乏库蚊的细胞基因组ＤＮＡ进行扩增，分别扩增出不同条带状数和分子大小的多态ＤＮＡ图谱，两种库蚊细胞的基因组ＤＮＡ扩增产物除了有相同分子大小的ＤＮＡ带外，还有一半条带为各自独特的条带，用淡色库蚊成蚊作ＲＡＰＤ－ＰＣＲ的扩增带与相应的细胞株产生的主要条带相符，实验结果表明，此技术方法简便，快速，精确，可用于