β受体和M受体信号转导通路介导的针刺抗心肌缺血效应机制研究进展

心肌缺血是最为常见的心血管病变,自主神经功能失衡可加重缺血性病理损伤。肾上腺素β受体(β-AR)是交感神经递质的受体,毒蕈碱乙酰胆碱受体(M-AChR)和烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是副交感神经递质的受体。目前针刺对心脏自主神经受体信号通路影响的研究主要集中在心肌β_1-AR和M_2-AChR这两个主要的亚型。结果表明,针刺能够使心肌细胞的β_1-AR表达下调,增加心肌细胞M_2-AChR的表达,逆转心肌缺血造成的刺激性G蛋白和抑制性G蛋白的异常表达,抑制腺苷酸环化酶的活性;同时,针刺还能够增加M_2-AChR的另一条信号转导途径的兴奋性,提高缺血心肌细胞中一氧化氮合酶和一氧化氮的活性,促进心肌细胞中环磷酸鸟苷的合成。最终,减少心肌细胞腺苷-3’,5’-环化一磷酸的合成,抑制蛋白激酶A的活性,减少钙离子内流,发挥对心肌细胞的保护作用。     

抗血管内皮生长因子受体1和2双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白的构建及其抗血管生成活性

目的 构建抗血管内皮生长因子受体1和血管内皮生长因子受体2双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白并研究其抗血管生成活性及作用机制。方法 构建抗血管生成寡肽A7、G6与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白表达载体;利用亲和层析进行蛋白纯化,产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱法分析;酶联免疫吸附法和免疫细胞化学分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白与内皮细胞的结合活性;CCK-8法检测A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1增殖的影响;蛋白质印迹法分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对血管内皮生长因子信号通路影响;划痕法分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1迁移的影响;小管形成分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1血管生成的影响。结果 成功获得A7/G6-力达霉素辅基蛋白融合蛋白,产量20 mg·L^-1培养基,纯度较高;A7/G6-力达霉素辅基蛋白具有与人微血管内皮细胞-1和人脐静脉内皮细胞结合的活性;较高浓度能够抑制人微血管内皮细胞-1的增殖;能抑制内皮细胞的迁移和体外血管生成;其作用机制是通过G6和A7抑制血管内皮生长因子信号通路中AKT蛋白的磷酸化引起的。结论 针对血管内皮生长因子受体构建的双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白具有抗血管生成的活性,为A7/G6-力达霉素辅基蛋白进一步体内活性研究和作为药物输送载体研究奠定了基础。     

以人表皮生长因子受体2为靶点的强化融合蛋白LDP-Hr-AE的构建及抗肿瘤活性研究

 目的 制备一种以人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）为靶点的由抗体重链超变区多肽与力达霉素组成的强化融合蛋白LDP-Hr-AE,并初步探讨其抗肿瘤活性。方法 通过聚合酶链式反应扩增出抗人表皮生长因子受体2抗体C6.5重链CDR3区的20个氨基酸残基基因,将其与力达霉素辅基蛋白基因连接构建出融合蛋白基因ldp-Hr,转化至大肠杆菌中进行诱导表达。融合蛋白LDP-Hr采用HisTrap Ni²⁺亲和色谱柱进行分离纯化,高效液相色谱法检测其纯度。细胞免疫荧光法和基于流式细胞术的亲和实验分析融合蛋白与肿瘤细胞的结合活性。纯化的LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外进行组装,构建出强化融合蛋白LDP-Hr-AE。采用MTT法检测强化融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性,Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术的方法检测LDP-Hr-AE蛋白对细胞凋亡的影响。结果 成功构建并表达了融合蛋白LDP-Hr,目的蛋白以可溶形式分泌至大肠杆菌培养液和周质腔中,产量可达每升发酵液40 mg活性蛋白,纯化后的蛋白经高效液相色谱法检测纯度为97.4%。细胞免疫荧光实验和基于流式细胞术的亲和实验检测结果均显示LDP-Hr蛋白与HER2高表达的肿瘤细胞系（如SK-BR-3和SK-OV-3细胞）都有很强的结合活性。LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外组装后经高效液相色谱法检测350 nm处出现特定吸收峰,表明强化融合蛋白LDP-Hr-AE构建成功。采用MTT法检测了强化融合蛋白的体外杀伤活性,结果显示,LDP-Hr-AE对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,且其杀伤活性要高于力达霉素。细胞凋亡检测结果也表明LDP-Hr-AE在极低的浓度下（如0.1 nmol·L^-1）即可强烈的诱导细胞发生凋亡,且凋亡的比率随着蛋白浓度的升高而增加。结论 本实验制备的强化融合蛋白LDP-Hr-AE可以特异的与人表皮生长因子受体2结合,对肿瘤细胞具有强烈的杀伤活性和诱导凋亡能力,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能。     

灯盏乙素对痴呆大鼠脑组织乙酰胆碱尼古丁受体蛋白及mRNA表达的作用

目的 观察灯盏乙素对痴呆模型大鼠乙酰胆碱尼古丁受体(nAChR)亚单位蛋白质和mRNA水平表达的影响,探讨其可能的作用机制。     

硒化壳聚糖通过促进PML-RARα融合蛋白与分子伴侣Hsp90解离下调融合蛋白水平

目的 研究硒化壳聚糖(Sc)下调NB4细胞PML-RARα融合蛋白的作用与分子伴侣Hsp90的关系.方法 流式细胞术和免疫印迹法检测Sc处理后NB4细胞内PML-RARα融合蛋白、Hsp90含量的变化; RT-PCR法分析Sc处理后细胞内PML-RARα mRNA水平的改变.结果 Sc可下调NB4细胞内PML-RARα融合蛋白含量,呈量效关系,50,100,200 mg/L Sc处理24 h后细胞内PML-RARα融合蛋白阳性率分别为62.8%, 33.14% , 17.07%, Sc对细胞内PML-RARα mRNA水平没有影响;50,100,200 mg/L Sc处理NB4细胞24 h可使细胞内Hsp90含量减少.结论 Sc下调PML-RARα融合蛋白的含量,主要通过抑制Hsp90分子伴侣的功能,使PML-RARα融合蛋白与Hsp90蛋白解离,PML-RARα融合蛋白失去正常的稳定性,进而被降解.     

重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白诱导胶原诱导型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的研究

 目的胶原诱导大鼠类风湿性关节炎(CIA)为动物模型,探讨重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白(rhTNFR:Fc)对CIA滑膜细胞凋亡的影响。方法Wistar大鼠模型随机分组,rhTNFR:Fc组和甲氨喋呤(MTX)阳性对照组按1.75mg·kg^-1剂量每日皮下注射给药,阴性对照组和正常对照组皮下注射等量生理盐水,31d后抽取膝关节滑液以ELISA法测定TNF-α水平;膝关节滑膜作苏木素-伊红染色(HE)、电镜、缺口末端标记法(TUNEL)标记检测凋亡。结果电镜下可见早期滑膜凋亡细胞,MTX组和rhTNFR:Fc组滑膜细胞凋亡数与阴性对照组比较明显增加,突变型p53的表达被明显抑制,P<0.05;MTX组和rhTNFR:Fc组膝关节滑液TNF-α、NO水平显著下降,与阴性对照组比较差异具显著性,P<0.01。结论首次阐明rhTNFR:Fc诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡,抗类风湿性关节炎可能通过下调p53,降低TNF-α、NO来诱导滑膜细胞凋亡,减轻CIA大鼠的关节炎症。     

BAP-SRC-1融合蛋白的表达及其在药物代谢酶调控研究中的应用

 目的获得活性表达的细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)基因和人甾体受体辅活化因子-1(steroid recep- tor coactivator-1,SRC-1)的融合蛋白,应用于辅活化因子与核受体的结合研究。方法从Escherichia coli JM83基因组和人肝总RNA中分别扩增获得BAP基因和SRC-1的186个氨基酸对应的基因序列(简称SRC186)。用重组技术,构建BAP-SRC186- pET28a融合基因表达载体,在Escherichia coli Rosetta(DE3)中,以IPTG低温诱导表达。以对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl-phos- phate,PNPP)为底物进行活性测定。活性表达的BAP-SRC186融合蛋白被应用于辅活化因子与核受体的结合研究。结果获得可溶性融合蛋白BAP-SRC186。该融合蛋白的BAP比活为(0.176±0.013 4)μmol·min^-1·mg(pro)^-1 在利福平存在的情况下,BAP-SRC186能与孕烷X受体配体结合域(pregnane X receptor ligand binding domain,PXRLBD)发生利福平剂量依赖性的相互作用,作用强度通过BAP的显色反应可方便地检测结论BAP融合蛋白与核受体的结合研究为药物代谢酶调控的体外研究开辟了新的思路。     

补肾中药对成骨细胞维生素D受体与核心结合因子α1蛋白表达的影响

为探讨补肾中药影响骨形成的机制,将SD大鼠随机分为正常组、生理盐水组、单味补阳组（固本壮骨胶囊）、复方补阳组（金匮肾气丸）、复方平补组（补肾益精方）、复方补阴组（知柏地黄丸）和西药对照组（萌格旺）7组,各组的含药血清分别干预16月龄大鼠成骨细胞,采用免疫组织化学方法检测药物干预后大鼠成骨细胞维生素D受体（vitamin Dreceptor,VDR）、核心结合因子仅α1（core binding factor α1,Cbfα1）蛋白的表达。结果：在大鼠成骨细胞中,单味补肾阳组、复方补肾阳组、复方平补组、西药对照组明显上调VDR、Cbfα1蛋白表达,复方补肾阴组明显下调VDR、Cbfα1蛋白表达。结论：补肾中药中,补阳中药和平补中药可能是通过上调成骨细胞VDR、Cbfα1蛋白表达,促进骨形成。     

黄芪桂枝五物汤通过α7nAchR调节M1/M2巨噬细胞极化促进白色脂肪米色化

目的 观察黄芪桂枝五物汤对肥胖小鼠白色脂肪米色化作用的影响。方法 50只8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机选取其中10只作为正常饮食组(NF组),其余40只高脂饮食诱导小鼠肥胖。将诱导成功的40只肥胖小鼠随机分为高脂饮食组(HF组)、β3受体激动剂CL316,243组(β3组)、CL316,243+黄芪桂枝五物汤组(HGWD组)、CL316,243+黄芪桂枝五物汤+α7nAchR选择性拮抗剂α-BGT(α-BGT组),分别给予对应药物连续处理2周。HE染色观察白色脂肪细胞大小;PCR法检测白色脂肪组织中产热基因,M1、M2型巨噬细胞标志基因及α7nAchR基因水平;ELISA检测白色脂肪组织炎性因子含量。结果 与HF组比较,β3组体重下降,脂肪细胞面积减小,产热基因增加,表明β3受体激动剂促进了白色脂肪米色化;而M1、M2型巨噬细胞标志基因及抗炎因子含量未有显著变化,促炎因子含量增加,表明肥胖机体炎症状态未改善;同时α7nAchR基因水平下降。与β3组比较,HGWD组促白色脂肪米色化作用进一步增加,炎症状态显著改善,α7nAchR基因水平上升。而同时给予α-BGT后减弱了黄芪桂枝五物...     

酸甘化阴法对NOD小鼠唾液腺中AQP5、M3R及外周血干燥综合征特异性抗体的影响

目的 探讨酸甘化阴法对NOD小鼠唾液腺中水分子通道蛋白-5(AQP5)、毒蕈碱受体3(M3R)及外周血干燥综合征特异性抗体的影响。方法 将8周龄NOD小鼠随机分为5组,每组15只。适应性饲养1周后,芍药甘草汤低、中、高剂量组分别给予相应浓度芍药甘草汤19.5 g/kg灌胃,同时给予生理盐水腹腔注射,1次/d;毛果芸香碱组给予毛果芸香碱注射液1.4 mg/kg腹腔注射,1次/d;生理盐水组给予生理盐水灌胃,1次/d。各组均连续干预6周后取颌下腺,HE染色观察病理形态,real-time PCR法检测腺体内AQP5和M3R mRNA表达情况;取血清,采用ELISA法检测血清中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗体含量。结果 生理盐水组和毛果芸香碱组NOD小鼠颌下腺淋巴细胞浸润明显,芍药甘草汤各剂量组小鼠淋巴细胞浸润灶较少。芍药甘草汤各组AQP5及M3R mRNA相对表达量和血清中抗M3R抗体含量均明显高于生理盐水组(P均<0.05),血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显低于生理盐水组(P均<0.05);芍药甘草汤中剂量组AQP5及M3RmRNA相对表达...     

小凹蛋白-1和清道夫受体-B1与动脉粥样硬化关系研究进展

<正>脂质紊乱和炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中发挥了重要的作用。其中胆固醇的逆向转运能力是决定动脉粥样硬化进程与转归的关键。目前还存在一类对动脉硬化的形成有特殊作用的蛋白,即血清逆转运蛋白。这类蛋白主要包括小凹蛋白和清道夫受体家族。小凹蛋白-1(CAV-1)既在载脂细胞胆固醇流出中发挥转运中心和关键分子的作用,也在炎症反应中发挥介导抗炎的信号转导作用。清道夫受体-B1(SR-B1)存在细胞膜上,能够促进胆固醇的逆向转运,清     

中药联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白治疗强直性脊柱炎疗效观察

目的观察中医辨证疗法联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)治疗强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)的临床疗效。方法选择35例AS患者,给予中医辨证疗法联合益赛普治疗,中医辨证治以补肾强督、通络止痛;益赛普皮下注射,25 mg/次,前3个月每周2次,后3个月每周1次。治疗3、6个月时进行疗效判定并观察ASAS20、ASAS50改善达标率。观察治疗前和治疗3、6个月时患者Bath强直性脊柱炎病情活动指数(Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index,BASDAI)、Bath强直性脊柱炎功能指数(Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index,BASFI)、脊柱痛VAS评分、夜间痛VAS评分、患者总体评分(patient global assessment,PGA)、医生总体评价VAS评分、中医证候积分、指地距、胸廓活动度、耳屏-墙距、腰椎侧弯、颈椎转动、Schober改良试验结果、ESR、CRP。结果与治疗前比较,治疗3、6个月时BASDAI、BASFI、脊柱痛、夜间痛、PGA、医生总体评价VAS评分、中医证候积分、指地距、胸廓活动度、耳屏-墙距、腰椎侧弯和Schober改良试验、ESR、CRP均降低,差异有统计学意义(P0.05)。治疗6个月时颈椎转动降低,其差异有统计学意义(P0.05)。与治疗3个月比较,治疗6个月时中医证候总有效率、ASAS20、ASAS50达标率升高差异有统计学意义(P0.05),BASDAI、BASFI、脊柱痛、夜间痛、PGA、医生总体评价VAS评分、中医证候积分、指地距、胸廓活动度、耳屏-墙距、腰椎侧弯、颈椎转动和Schober改良试验、ESR、CRP均降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论中医辨证联合益赛普可以较好地减轻炎症反应,控制活动性AS的病情,改善关节功能活动。     

钟声蛋白样受体的研究及现状

目的:整理钟声蛋白样受体(Toll样受体,TLRs)研究资料,为中药抗炎免疫药物的作用靶点研究提供思路与方法.资料来源:主要搜集近10年来国内外学者公开发表的对Toll样受体的研究成果,对其进行整理与分析.资料选择:综述Toll样受体的发现、分布、结构特征,尤其是其效应细胞配体、信号转导途径及功能研究资料,综合分析其研究现状.结果:目前的研究主要集中在对Toll样受体信号转导通路的基础研究上,而对药物的研究却极为匮乏.结论:对Toll样受体信号转导通路的进一步研究可能会为某些疾病的防治提供科学依据,同时为中药抗炎免疫药物作用靶点的研究提供新的思路与方法.     

乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力模型的研究

目的 研究用乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型.方法 给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段,观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化,应用低频重复电刺激检测电衰减反应,并与对照组鼠比较.结果 模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状,体重增长缓慢或下降,甚至消瘦,毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落,再次加强免疫后上述症状明显加重.Lennon临床评分29只评分在1级以上,并行RNS检测,36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%,而对照组衰减率均<10%,两组比较差异有显著性(P<0.01).结论 皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型.     

以勿动蛋白-A及其受体为靶点的促神经再生中药研究

查阅相关数据库文献38篇,整理和分析了中药对勿动蛋白-A( Nogo-A)及勿动蛋白受体(NsR,Nogo receptor)调节作用的研究.探讨Nogo-A及NgR这2个药物靶点相关的中枢神经系统(CNS)损伤修复中药的研究进展.基于对Nogo-A的表达分布和功能作用,Nogo-A单克隆抗体与NgR拮抗剂的认识,进一步了解CNS损伤修复的机制,对于中枢神经系统再生障碍的药物治疗有重要的临床意义.中药可以诱导CNS产生有利的微环境促进神经再生.Nogo-A及NgR的表达可抑制神经的发生,中药可抑制其表达从而发挥神经保护的作用.但Nogo-A在脑损伤治疗中的研究还处于基础阶段,使用中药(髓复康、首乌仙海片、血塞通、三七三醇皂苷、逍遥散、补阳还五汤、左归丸和右归丸等)调节Nogo-A及其受体NgR的表达少见报道,机制未明.故探讨Nogo-A及NgR作为药物开发靶点的潜在价值,为今后中药临床治疗该靶点相关的疾病及促神经再生中药新药研发提供一定的参考.     

老年大鼠脑M受体亚型的变化及知母的调整作用

用M_1受体选择性拮抗剂PZ对~3H—QNB与青年大鼠脑受体结合的竞争抑制实验,通过双位点数学模型求出M_1、M_2两种亚型受体的RT及K1值,均与文献值相近。对老年大鼠的平行实验表明,老年组脑内高亲和力受体(M_1)数明显降低,但亲和力不变;低亲和力受体(主要为M_2)数量及亲和力均无明显变化。连续口服知母水提物3～4个月的老年大鼠与配对的对照老年大鼠相比,表明知母能明显提高高亲和力受体的数量,但不影响其亲和力;知母对低亲和力受体数量及亲和力均无明显影响。     

简单差示蛋白获取法鉴别2种海蛇的应用

目的建立简单差示蛋白法,获取两种海蛇的特征蛋白用作专属鉴别。方法采用SDS-PAGE与West-ern-blot结合分析并取差示蛋白直接测序。结果确认1号海蛇的特征蛋白为14.6kD及8.7kD两个组分,2号海蛇的特征蛋白为16.7kD及10.2kD两个组分,并完成14.6kD及10.2kD氨基酸测序。结论采用一维电泳结合抗原分析,方法简单,可以获取差示蛋白用于中药材基原鉴别。     

燧心胶囊对心衰大鼠线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达的影响

目的 探讨燧心胶囊对心衰大鼠线粒体融合蛋白Mitofusin 1(Mfn1)和Mitofusin 2(Mfn2)表达的影响.方法 60只SD大鼠随机分入对照组、模型组、缬沙坦组和燧心胶囊低、中、高剂量组,每组10只,雌雄各半.除对照组外,其余各组大鼠采用阿霉素(ADR)制备慢性心衰大鼠模型.建模成功后,缬沙坦组和燧心胶...     

消癃通闭对犬大脑皮层α1-肾上腺素受体的拮抗作用

消癃通闭浸出液与犬大脑皮层粗制膜及IBE125作用测定其对IBE125与犬大脑皮层α1-AR结合的抑制作用,结果消癃通闭对IBE125犬大脑皮层的结合呈竞争性拮抗作用,IC50为34.0±6.0g/L,Hill系数为0.70±0.06,佐证本方具有α1-AR拮抗作用.     

洗心汤对APP/PS1双转基因小鼠突触功能相关蛋白及受体表达的影响

目的观察洗心汤对APP/PS1双转基因小鼠空间学习记忆能力、海马CA1区突触超微结构和突触功能相关蛋白及受体表达的影响,初步探讨洗心汤方治疗阿尔茨海默病的作用机制。方法选用8周龄雄性APP/PS1双转基因小鼠,分为模型组、盐酸多奈哌齐组、洗心汤组,另以同窝阴性小鼠设立空白对照组,每组15只。连续灌胃给药6个月后进行相关指标检测。采用Morris水迷宫实验观测APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力;透射电镜观察小鼠海马CA1区突触超微结构;分别采用免疫荧光法及免疫印迹法检测APP/PS1转基因小鼠海马CA1区突触后致密物质-95(PSD95)、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(NMDAR2B)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、生长相关蛋白43(GAP43)表达水平。结果与空白对照组比较,模型组逃避潜伏期延长,在目的象限游泳距离与穿越平台次数的百分比降低(P0.01);与模型组比较,洗心汤组小鼠逃避潜伏期均值总体下降(P0.01,P0.05),在目的象限游泳距离及穿越平台的次数占总路程与总穿越平台次数的百分比显著增加(P0.01,P0.05)。电镜结果表明,洗心汤组较模型组神经元细胞密集,细胞核多为圆形,核内染色质轻度凝集,核仁可见;细胞质内线粒体轻度肿胀,粗面内质网轻度扩张,游离核糖体丰富,脂褐素颗粒少见,突触结构基本清晰。免疫荧光结果表明,海马CA1区PSD95、NMDAR2B、MBP、GAP43蛋白表达明显增加(P0.05,P0.01),免疫印迹实验中其含量亦呈现高表达水平(P0.05,P0.01)。结论洗心汤对APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆功能具有明显的改善作用,其机制可能与影响小鼠海马突触结构,提高小鼠海马突触功能蛋白及受体表达有关。