胚胎冻贮的研究现状

194 9年 ,Ｐｏｌｇｅ首先冻贮哺乳动物精子获得成功。50年代开始了对胚胎冻贮的研究。 1972年英国Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ首先成功地冻贮了小鼠胚胎。 1983年澳大利亚Ｔｒｏｕｓｏｎ和Ｍｏｈｒ等成功地冻贮了人体胚胎并作宫内移植获得成功。克服冷冻损伤 ,提高复温后胚胎的存活率 ,是胚胎冻贮面临的最主要问题。一、胚胎冷冻的原理 (ＧｅｎｅｒａｌＣｒｙｏｂｉｏｌｏｇｉｃＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＥｍｂｒｙｏ)冷冻既可保存活细胞 ,也可以对它们造成损害。低温能抑制生物体的生化活动 ,降低新陈代谢而使细胞得以保存。细胞生存所需的基本…     

冷冻前平衡处理对人精子冻融后相关参数的影响

目的:研究冻前平衡处理对冷冻精子复苏率的影响,优化一步熏蒸法,以寻找人类精子冷冻的最优方法。方法:使用50例自愿供精者的正常精液标本,同1例供精者的精液一式3份,分别采用不平衡直接冷冻法、室温平衡10 min后冷冻与4℃平衡10 min后冷冻的方法进行处理。复苏后用计算机辅助精液分析(CASA)系统分析3组标本冷冻前后精子运动参数的变化,并检测各组标本精子的畸形率和存活率。结果:4℃平衡组的前向运动精子复苏率[(61.88±16.94)%]显著高于未平衡组[(48.61±16.44)%]和室温平衡组[(49.41±13.77)%](P<0.05),而室温平衡组与未平衡组前向运动精子复苏率则无显著性差异。3组标本经冷冻复苏后其精子畸形率和存活率无显著性差异。结论:冻前4℃平衡10 min的冷冻前处理方法操作简单,实验条件易控,对提高精子复苏率有重要意义。     

人精子超低温冻贮技术的研究(三)——不同的甘油浓度、初冻温度和药物对精子存活率的影响

材料和方法基本材料和方法同上文研究(一)。不同之处在各实验栏中注明。一、不同的甘油浓度对冻贮复温后的精子存活率的影响实验用10份精液标本。每份精液液化后均分为5份,按精液:保护剂=1:1之比,分别添加五种不同的保护剂,细管法分装,冷平衡30分钟,-110℃初冻温度冷冻,保护剂按甘油浓度不同分 A、B、C、D、E 五组,与精液混合后甘油最终浓度依次为3%、     

人精子超低温冻贮技术的研究(一)——不同的冻贮方法、冷平衡时间对精子存活率的影响

关于精液冻贮技术虽国外已做了大量的研究,但一些研究结果不无矛盾。为了寻找适合我国使用的简便、有效的精液冻贮方法,我库从1984年12月开始,以液氮为致冷源,用自行研制的精液冷冻设备,对人精子超低温冻贮技术进行了一系列比较性研究。从1985年2月至1986年2月,共做冻精人工授精118例,181周期。确知怀孕和已生育者33例,周期成功率为18.23%(另文报道)。现将精子冻贮技术的实验研究结果报道如下。     

精子冻存技术及上游法精子处理技术对精子DNA完整性的影响

目的通过对冷冻前后及精子处理前后精子DNA完整性的比较,探讨冷冻技术、冷冻时间及上游法精子处理技术对精子DNA完整性的影响。方法（1）精液常规检测正常的患者30例,手淫法取精,精液液化混匀后分4份,分别用于精子染色质扩散（SCD）实验检测精子DNA完整性、上游法处理精液、以及两组冻存实验（不加保护剂直接冻存的为冻存1组;添加蛋黄葡萄糖保护剂冻存的为冻存2组）;（2）上游法处理后的精液一部分用于检测精子动力和形态,一部分用于精子DNA完整性检测;（3）冻存1组分别于冻存第7天和第90天解冻,SCD实验检测精子DNA完整性;（4）冻存2组分别于第7天和第90天解冻,0．1ml用于精子DNA完整性检测,剩余精液应用上游法处理,检测上游处理前后精子DNA的完整性。结果（1）冻存1组中,冻存90d后解冻的精子DNA损伤率[（25．6土7．3）％]显著高于冻存7d者[（22．4±7．4）％]（P〈0．05）,且均显著高于新鲜精液的精子DNA损伤率[（20．6±7．3）％]（P〈O．05）;冻存2组中,冻存90d后精子DNA损伤率显著高于冻存7d者[（25．9±7．2）％VS．（23．6土7．8）％]（P〈O．05）,且均显著高于新鲜精液（P〈0．05）;而冻存7d和90d后,两个冻存组间比较,精子DNA损伤率均无显著差异（P〉0．05）。（2）新鲜精液经上游法处理后,精子DNA损伤率由处理前的（20．6±7．3）％降为（6．4±2．5）％（P〈O．05）;冻存2组中精液冻存7d和90d后复苏上游法处理后,精子DNA损伤率较未经上游法处理者均显著降低[分别为（9．38±2．8）％VS．（23．6±7．8）％和（9．7±2．6）％VS．（25．9±7．2）％]（P％0．05）。结论冻存对精子DNA有损伤,冻存时间对于精子DNA完整性有影响。不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异。不论是新鲜精液还是冻存复苏精液,上游法处理并不会增加精子DNA的损伤,且有利于筛选出具有更好DNA完整性的精子。     

冷冻精子受精能力的综合评价

目的：观察不同冷冻期冷冻精子的受精能力。方法：应用精液常规分析（ＳＦＡ）、精子尾部低渗肿胀试验（ＨＯＳ）、去透明带地鼠卵穿透试验（ＨＯＰ）及冷冻精液人工授精（ＡＩＤ）对冷冻前后及不同冻存期的精液标本进行综合性检测。结果：１０份正常精液标本的冷冻精子活动率、ＨＯＳ值、ＨＯＰ值均明显低于冷冻前（Ｐ＜０．００１），而不同冻存期的精液行ＡＩＤ术后的总妊娠率与新鲜精液ＡＩＤ术的总妊娠率比较，则基本相同。结论：精子细胞膜虽在冷冻复温过程中受到一定的损伤，使精子活动率和受精能力下降。但是，精液的长期冻存及精子细胞膜部分改变并不完全影响精子的受精能力。     

冷冻精子受精能力的综合评价

目的：观察不同冷冻期冷冻精子的受精能力。方法：应用精液常规分析（ＳＦＡ）、精子尾部低涌肿胀试验（ＨＯＳ）、去透明带地鼠卵穿透试验（ＨＯＳ）及冷冻人工授精（ＡＩＤ）对冷冻前后及不同冻存期的精液标本进行综合性检测。结果：１０份正常精液标本的冷冻精子活动率，ＨＯＳ值，ＨＯＰ值均明显低于冷冻前（Ｐ〈０．００１），而不同冻存期的精液行ＡＩＤ术后的总妊娠率与新鲜精液ＡＩＤ术的总妊娠率比较，则基本相同。结论：精     

冻储时间对冷冻精子复苏率的影响

目的 :探讨冻储时间对冷冻精子复苏率的影响 ,以期找到最佳复苏时间。　方法 :取 88份正常供精者标本进行精液常规分析 ,精液用程序降温仪通过三步降温法冻存后置 - 196℃液氮中冻储 ,88份冻存标本随机分成 5组 ,分别于冻存后的 1d(Ⅰ组 ,n =14 )、7d(Ⅱ组 ,n =2 4 )、30d(Ⅲ组 ,n =19)、180d(Ⅳ组 ,n =18)、30 0d(Ⅴ组 ,n =12 )取出 ,37℃水浴复苏 ,再次进行精液常规分析。计算冷冻复苏率。　结果 :5组间的复苏率差异均无显著性 (P均 >0 .0 5 ) ,冻储时间与复苏率之间无相关性 (r=- 0 .0 5 ,P >0 .0 5 )。　结论 :程序降温仪冻存精液标本置 - 196℃液氮后 2 4h即可复苏分析 ,便于人类精子库耐冻实验批量筛查     

DNA流式细胞术分析人精液

Ｈａｃｋｅｒ ＫｌｏｍＵＢ ,ＧｏｈｄｅＷ ,ＮｉｅｓｃｈｌａｎｇＥｅｔａｌ ＤＮＡｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｈｕｍａｎｓｅｍｅｎ ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ ,1999,14(10 ) :2 50 6 2 512　　流式细胞术可确定各种细胞群的相对比例 :成熟的单倍体精子及异常成熟的双倍体精子、细胞碎片、未成熟的胚细胞 (单倍体圆形精子细胞、双倍体细胞、Ｓ期及 4Ｃ细胞 )和白细胞等。作者采用流式细胞术及传统显微技术分析了 155例不育患者的 171份精液标本 ,结果显微发光法及流式细胞术所测精液中的精子浓度呈直线相关 (甚至精子浓度 <2 0× 10 6 /ｍ…     

人类冻精人工授精的临床应用

人类精子的冷冻贮存及人工授精,不仅对某些男性不育症的治疗有一定价值在人类优生及计划生育方面也有重要意义。我院采用简易而有效的深低温冻贮志愿供者精液,从1986年11月底至1988年5月进行人工授精共82例110周期,报告如下: 一、精液冻贮方法: 采用液氮作储存介质进行深低温冻贮     

三种人类精液冷冻程序的比较性研究

<正>冷冻方法直接影响到精子的复苏率,也是能否达到技术规范要求的重要指标之一。我们对精液的冷冻存储方法进行了研究分析,分别采用传统的缓慢冷冻储存法(缓冻法)、Planer程序降温仪 (PLANER-KRYO10 Ⅲ,Planer,英国)随机冷冻程序(Planer 随机程序)和Planer改进程序降温仪冷冻程序(Planer改进程序)3种方法行精液冷冻存     

Percoll法处理对人精子运动参数的影响

为观察来源于３种不同精液标本精子运动参数的差异及其Ｐｅｒｃｏｌ处理后的变化，本文对新收集的正常精液精子（Ⅰ组），少精及弱精症精子（Ⅱ组）及正常精液冻融精子（Ⅲ组）各１０份，分别于Ｐｅｒｃｏｌ处理前后用电子计算机精液分析仪（Ｃｏｍｐｕｔｅｒａｓｉｓｔｅｄｓｅｍｅｎａｎａｌｙｓｅｒ）进行运动特性分析，记录ＭＯＴ、ＶＳＬ、ＶＣＬ、ＬＩＮ、ＡＬＨ、及ＶＡＰ６项参数，其结果进行统计学分析。Ｐｅｒｃｏｌ处理后，各组精子６项参数值均较处理前提高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５～０．００１）。处理前Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组除ＶＳＬ无显著差异外，余５项参数值均有显著差异。Ⅲ组的ＡＬＨ，ＶＣＬ最高，其它参数Ⅰ组最高。Ｐｅｒｃｏｌ处理后差异值降低。Ｐｅｒｃｏｌ处理后精子运动６项参数值均提高；异常精液精子运动特性与正常精液精子有明显差异；正常精子冷冻复苏后其ＶＣＬ及ＡＬＨ明显提高。     

人类精液细管一步冷冻法研究

本文介绍了一种作者自创的人类精液快速冷冻保存方法———精液细管一步冷冻法。通过与电脑程序化逐步冷冻法、液氮蒸气逐步冷冻法，以及其它常用的快速精液冷冻法在冻融后精子复苏率（ 本研究结果：６８ ．３ ±８ ．６ ％ ） ，临床人工授精效果（ 本研究结果：妊娠率４２ ．８ ％ ；流产率１１ ％ ） 以及操作特点等方面进行比较，显示精液细管一步冷冻法是一种操作较简便，并能保持用细管作为精液冻贮容器所具有的精子库贮存量大、标本易存取和可与常用人工授精器械（ 法国凯苏设计的，目前国外流行使用的 Ａ Ｉ Ｄ 器材） 配合使用等优点，同时又具有良好的临床人工授精效果的人类精液快速冻贮方法。     

程序性冷冻仪和液氮冻融技术导致细胞冷冻损伤的评估

用精子活力、染色质正常性、形态学指标及细胞膜完整性等指标评估程序性生物冷冻仪和液氮蒸汽冷冻技术对人类精子的负面效应 (冷冻损伤 )。 4 4份病人精液标本用吖啶橙染色确定染色质冷冻损伤 ,形态学依据ＷＨＯ标准评估 ,用低渗肿胀试验评估精子膜的完整性 ,用薯红 苯胺黑染色确定精子存活率。所有的指标经过 2种不同的冷冻技术冻融后都较处理前有所改变 ,其中染色质固缩率反映液氮蒸汽法较生物冷冻仪法损伤严重 ,其他指标 2种方法间没有显著性差异。研究者推荐使用计算机程序性冷冻仪法处理精子。程序性冷冻仪和液氮冻融技术导致细胞冷冻…     

维生素E对人精子冻融氧化应激损伤的保护作用

目的:探讨水溶性维生素E(Trolox)对冻融人精子氧化应激损伤的可能保护作用及机制。方法:选取16份健康生育男性的精液标本,分析精液常规参数及动力学参数后,将每份精液一式4份,1∶1加入冷冻保护液后混匀,不含水溶性维生素E者设为阴性对照组(G0),而G1、G2、G3实验组混合液中分别含有50、100、200μmol/L浓度的水溶性维生素E,冷冻复苏精液常规分析,检测复苏后精液中活性氧(ROS)水平,采用硫巴比妥酸法(TBA)检测精子中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)浓度。结果:冻融后各组精子运动参数较新鲜精液参数均明显下降(P0.01),G2组前向运动精子百分率[(53.33±5.63)%]较对照组[(47.85±5.09)%]明显改善(P0.05),精子VCL和VAP高于阴性对照组(P0.05)。G2组与G3组的ROS及MDA均低于阴性对照组(P0.05)。结论:在精液冷冻保护液中添加一定浓度的水溶性维生素E可以减少精子冻融过程中产生的过量ROS,减轻ROS对精子质膜的氧化应激性损伤,从而提高冻融后的精子活力。     

膀胱移行细胞癌cyclin D1及Ki-67抗原表达及相关性的研究

细胞周期失控是肿瘤细胞呈无限制增殖的重要原因 ,ｃｙｃｌｉｎＤ1在细胞周期Ｇ1期和Ｇ1/Ｓ期转换处起重要的调控作用 ,Ｋｉ 6 7抗原能准确地评估肿瘤细胞的增殖活性。我们观察分析了ｃｙｃｌｉｎＤ1和Ｋｉ 6 7抗原在膀胱移行细胞癌 (ＴＣＣ)中的表达 ,并探讨二者的相关性。材料与方法　膀胱ＴＣＣ组 45例 ,男 35例 ,女 10例 ,平均年龄 5 8岁。ＵＩＣＣ临床分期 :浅表性肿瘤 (Ｔａ～Ｔ1)2 8例 ,浸润性肿瘤 (Ｔ2 ～Ｔ4 ) 17例 ;ＷＨＯ病理分级 :Ｇ12 0例 ,Ｇ2 15例 ,Ｇ3 10例 ;其中肿瘤初发 2 7例 ,复发 18例 ;肿瘤单发 32例 ,多发 13例。 12…     

番茄红素对人精子冷冻损伤的保护作用及机制研究

目的:通过在人精子冷冻保护液中添加不同浓度的番茄红素,研究番茄红素对精子冷冻损伤的可能保护作用及机制。方法:选择吉林省人类精子库捐精者的精液标本25份,每份精液一式4份,3∶1加入冷冻保护液后混匀,不含番茄红素者设为对照组(Ly0),而Ly2、Ly5、Ly10实验组混合液中分别含有2、5、10μmol/L的番茄红素,冷冻复苏精液进行常规分析,采用流式细胞术分析冻融后各组精子的凋亡率;采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法检测精子中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)浓度。利用JC-1标记法检测线粒体膜电位。结果:冻融后各组精子运动参数较新鲜精液参数均明显下降(P<0.01),Ly5组冻融后精子凋亡率[(25.68±4.36)%]较对照组[(33.26±4.78)%]显著下降(P<0.05);Ly5组线粒体膜电位水平[(66.18±14.23)%]显著高于对照组[(55.24±12.31)%],P<0.05;Ly2、Ly5、Ly10组的MDA水平与对照组比较,无统计学差异(P>0.05)。结论:在精液冷冻保护液中添加一定浓度的番茄红素可以减少线粒体氧化损伤,减轻活性氧对精子质膜的氧化应激损伤,从而提高精子的抗凋亡能力。     

浙江省人类精子库供精者精液参数及精子耐冻性变化分析

目的 了解供精者捐精过程中精液参数、精子耐冻性变化以及为人类精子库实验室质量控制提供部分依据;方法 13261份精液样本均来自2006年9月至2010年12月浙江省人类精子库的1513例合格的供精者,年龄20～42周岁,职业以学生为主,对所有精液标本进行精液常规分析;达到冷冻标准的精液标本进行冷冻及冷冻复苏后精液常规分析.结果 1513例供精者中,每次捐精均合格的为343例,占22.7%;每次捐精(至少连续3次)均不合格的为68例,占4.5%;捐赠精液至少一次不合格的为1102例,占72.8%.捐赠的13261份精液中,有10158份冷冻复苏后达到外供标准,占76.6%;不合格的捐赠精液为3103份,占23.4%,其中,未达到冷冻标准的为1565份,占所有捐赠精液的11.8%;冷冻复苏后未达到外供标准(不耐冻精液)为1538份,占所有捐赠精液的11.6%.结论 人类精子库供精者每次捐赠的精液不仅精液参数变化较大,其耐冻性变化也很大;所捐赠的精液不合格比例较高.     

人类精子库及其应用

一、历史回顾人类精子库是超低温冷冻贮存人精子的设备,泛指冷贮人精子的医疗或研究单位。自1776年,Spallanzani发现冰雪可以冷贮人精子以来,人精子冷冻贮存的研究已有200多年的历史。1866年,Mantegazza报道,人精子可耐受-15℃低温冷冻,并最先倡导建立人类精子库(Human Sperm Bank)。限于当时的条件,冷贮的精子只能存活很短的时间。1938年,Jahnel在研究性病时,意外发现存放在玻璃试管内的人精子,经-79、-196、及-269、5℃冷冻并冷贮在-70℃低温中40天,解冻后仍有活动精子。1940年Shettles证实了Jahnel的发现。并发现分装在毛细管内的精子经-269、5℃冷冻后,仍可存     

MMP2、MMP9和TIMP1在膀胱癌中的表达及与预后的关系

采用免疫组化方法观察膀胱移行细胞癌 (ＴＣＣＢ)组织中ＭＭＰ2、ＭＭＰ9和ＴＩＭＰ1的表达 ,探讨其在ＴＣＣＢ浸润、转移中的作用及预后价值。材料和方法　ＴＣＣＢ标本 5 1例 ,男38例、女 13例 ,年龄 2 8～ 81岁 ,平均 5 1岁。肿瘤直径 0 .3～ 6 .5ｃｍ ,初发肿瘤40例 ,复发性肿瘤 11例 (2 4次 ) ,复发次数 2～ 6次。按ＴＮＭ分期 :Ｔｉｓ～Ｔ12 1例、Ｔ2 14例、Ｔ3 12例、Ｔ4 4例。按ＷＨＯ标准 :Ｇ118例、Ｇ2 2 3例、Ｇ3 10例。术后45例患者获随访 ,随访时间 6～ 6 2个月。免疫组化采用Ｓ Ｐ法 ,已知乳腺癌阳性切片作为阳性对照 ,正常膀…