2011-2012年杭州市手足口病的病原构成及肠道病毒71型的分子流行病学特征

目的 探讨杭州市手足口病病原谱构成及其肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)的分子特征。 方法 采集210例疑似手足口病感染者的粪便标本及其相关临床资料,采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)方法进行初步检测,利用RT-PCR扩增部分EV71和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16, Cox A16)阳性样本VP1基因区并测序分析。 结果 荧光定量RT-PCR检测表明,210例疑似感染者的粪便中, EV71、Cox A16 和其他肠道病毒的阳性率分别为60.95%(128/210)、21.43%(45/210)和9.05%(19/210)。10株EV71病毒VP1区核酸序列与JX509922、JX509924、JX509926、JX509927、 JX509928和 JX509929的同源性最高为95.7%~98.0%,且均属于EV71中 C4a亚型。 结论 EV71和Cox A16是杭州市儿童手足口病的主要病原体。因此加强EV71和Cox A16的监测特别是EV71的检测,有助于更好地预防和控制手足口病。     

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。     

肠道病毒71型RT-LAMP快速检测方法的建立及初步应用

目的建立手足口病肠道病毒71型(EV71型)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法,并对其进行应用评价。方法利用软件针对EV71型病毒特异性基因6个区域设计4条LAMP引物,在普通恒温水箱内65℃保温约1 200min完成RT-LAMP扩增,扩增结果通过电泳和肉眼来判断。利用RT-LAMP和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法同时检测70份EV71型肠道阳性标本;将EV71型的RNA做一系列10倍稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感度。结果 EV71型出现LAMP特征性梯状条带,肉眼可以判断结果;RT-LAMP与RT-PCR方法检测100份EV71型标本的检出率比较差异无统计学意义(P0.05);RT-LAMP方法的敏感度(10.0pg/μL)与RT-PCR方法相同。结论建立了一个可以在普通恒温水箱内进行核酸扩增的EV71型RT-LAMP检测方法,初步应用证实该方法有一定的应用前景。     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价

目的利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。方法通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法,对研究数据进行Kappa一致性分析。结果 SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。结论本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。     

2015年杭州市手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型构成变化与联合检测方法分析

目的 采用肠道病毒核酸和抗体检测,分析2015年杭州市手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）构成变化及检测方法学评价。方法 收集2015年4-8月手足口病患儿663例,采用荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肠道病毒核酸,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清EV71-IgM、Cox A16-IgM。结果 663例手足口病患儿通用核酸阳性组58.52%（388/663）,EV71组19.16%（127/663）,与2014年比较,通用核酸阳性组比例（2=166.306,P=0.000）,EV71组比例（2=134.418,P=0.000）差异有统计学意义。手足口病患儿轻症487例,占73.45%,以通用核酸阳性组65.91%（321/487）为主;重症176例,占26.55%,EV71组43.75%（77/176）、通用核酸阳性组38.07%（67/176）位居前2位。不同组别出现重症的比例（2=98.395,P=0.000）差异有统计学意义,EV71出现重症比例最高,为60.63%（77/127）。病毒核酸检测和血清抗体检测阳性率比较差异有统计学意义（2=44.487,P=0.000）。其中,127例EV71阳性患儿,核酸和抗体检测双阳性率为59.85%（76/127）,单阳性率为40.15%（51/127）;64例Cox A16阳性患儿,核酸和抗体检测双阳性率为9.38%（6/64）;单阳性率为90.62%（58/64）。以核酸定量RT-PCR为标准,EV71/Cox A16-IgM抗体特异度86.61%,敏感度69.49%。结论 2015年与2014年比较,杭州市手足口病病原学流行特征有明显变化。采用病毒核酸和抗体联合检测,可提高实验室的检测阳性率,临床分型有助于辅助指导临床治疗;通用型重症病例增多,需寻找更适合的联合检测方法。     

502例手足口病患儿实验室检测结果的分析

目的观察手足口病患儿的实验室检测结果,并探讨其意义。方法收集502例(重症型104例,轻症型398例)手足口病住院患儿的咽试子标本,采用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法对手足口病患儿肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇病毒A组16型(CA16)核酸进行检测。同时检测白细胞(WBC)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)并进行分析。结果 502例手足口病患儿中,EV、EV71、CA16感染阳性分别为384例(76.49%)、262例(52.19%)、39例(7.76%)。男性患儿多于女性患儿,104例重症型手足口病患儿中,EV71阳性率为92.31%;502例手足口病患儿中有402例3岁。104例重症型患儿有97例(93.27%)3岁;其中EV71阳性率92.78%(90/97)。重症型与轻症型相比,重症型手足口病患儿WBC、LDH、CK-MB、DBIL和ALT水平较高(P0.05)。结论手足口病患儿以3岁为主,感染的肠道病毒主要为EV,引起重症型的主要病原体为EV71。     

逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒

目的建立一种检测肠道病毒71型（EV71）快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。方法针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型（CA16）无交叉反应发生。所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为1.0×102copies/mL。RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致。结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测。     

2013-2014年漳州市手足口病的病原学特征及分子流行病学研究

目的 了解2013-2014年漳州市手足口病的病原构成及分子流行病学特征,为漳州市手足口病的防治工作提供科学依据。方法 采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）方法,检测2013-2014年漳州市哨点医院送检的1421份临床诊断手足口病疑似病例的标本,进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的核酸检测;通过RT-PCR方法,扩增VP1区基因部分片段并测序,对非EV71及非Cox A16的肠道病毒进行分型鉴定;扩增完整VP1区基因片段并测序,构建系统进化树对EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10进行基因进化分析。结果 1063份标本肠道病毒通用型阳性,阳性率为74.81%,其中222份标本EV71阳性,340份Cox A16阳性,8份EV71+Cox A16阳性,493份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性。随机抽取40份非EV71及非Cox A16的肠道病毒阳性标本经RT-PCR和测序进一步分型,共鉴定出38份非EV71及非Cox A16的肠道病毒,其中Cox A6型25份（65.79%,25/38）,Cox A10型8份（21.05%,8/38）,Cox A5型1份（2.63%,1/38）,Cox A4型3份（7.89%,3/38）和Cox A9型1份（2.63%,1/38）。VP1区完整基因的进化分析显示,漳州市的EV71均属C4基因亚型的C4a进化分支,Cox A16分属B1基因亚型的B1a和B1b两个分支;Cox A6和Cox A10均与原型株及国外地区分离株的亲缘关系远,与国内地区分离株的亲缘关系近。结论 2013-2014年漳州市非EV71及非Cox A16的肠道病毒在手足口病病原谱中占有重要位置;非EV71及非Cox A16的肠道病毒型别多样,Cox A6和Cox A10为其中的优势型别。漳州市的EV71、Cox A16、Cox A6和Cox A10标本在进化树上与国内地区相应分离株共进化共循环。     

2008-2013年湖北省十堰地区手足口病病原谱动态分析

目的分析十堰地区手足口病病原谱构成及其动态变化,为该病的预防控制提供参考。方法 2008年5月至2013年12月,从十堰市各县(市、区)收集2076例手足口病临床诊断病例标本,用一步法反转录聚合酶链反应(one-step RT-PCR)和实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)法进行手足口病毒核酸检测并分型,结合病例基本信息,对判定为手足口病的确诊病例,采用描述流行病学方法进行病原谱动态分析。结果 2008-2013年,肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组(Cox A16、Cox A6、Cox A10)及其他型人肠道病毒(EV)在手足口病确诊病例中的病原构成比依次为46.35%(24.19%~62.23%)、38.12%(13.06%~70.97%)、5.99%(0~13.06%)、3.75%(0~8.28%)和5.79%(1.37%~15.12%)。Cox A6与Cox A10致病对象为≤5岁婴幼儿;4-6月出现夏季流行高峰,10-11月出现冬季流行小高峰;各县(市、区)流行的手足口病毒均在4种以上,Cox A6所占比例持续上升,2013年达到13.06%。结论 2008-2013年十堰地区手足口病流行较为严重,病原体包括EV71、Cox A16、Cox A6、Cox A10等多种型别肠道病毒,EV71与Cox A16逐年交替维持着优势地位,Cox A6近2年有持续上升的趋势值得关注。国家在今后的疫情防控、疫苗策略和临床管理中,应高度重视手足口病持续流行过程中病原谱的变化。     

2010年天津市手足口病病原学与分子流行病学分析

目的 对天津市2010年的手足口病(HFMD)病例进行病原学分析,并对引起该市HFMD流行的肠道EV71型和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)进行分子生物学特征分析。 方法 利用Real-time PCR检测HFMD病例标本,用人横纹肌肉瘤(RD)细胞对Real-time PCR检测阳性的部分病例标本进行病毒分离,用RT-PCR法扩增VP1全基因,使用生物学软件进行序列和系统发生分析。 结果 共检测HFMD病例1766例,肠道病毒总检测阳性率为71.52%(1263/1766),其中EV71占43.94%,Cox A16占41.65%,其他EV占14.41%。15株EV71分离株与C4亚型的C4a分支代表株具有最高的核苷酸序列同源性,均归属于C4a分支;9株Cox A16分离株与B1亚型的代表株具有最高的核苷酸序列同源性,其中8株属于B1b分支,1株属于B1a分支。 结论 导致天津市2010年HFMD流行的EV71流行株为C4亚型中的C4a病毒株,Cox A16流行株为B1亚型的B1b病毒株。     

2008-2009年湖北省十堰市手足口病监测分析

目的了解湖北省十堰地区手足口病的流行状况与病原动态分布变化,进一步优化检测方案,以探求该市手足口病的流行特征与防控对策。方法分析该市2008-2009年手足口病临床诊断病例的报告资料;收集十堰市233例手足口病病例的疱疹液或咽拭子标本,提取病毒RNA,以RT-PCR或荧光定量PCR进行核酸检测分型。结果手足口病全年均可在该市各地流行,病原以CA16和EV71型为主;时间分布:以5-7月为主;年龄分布:以5岁散居或幼托儿童为主;检出率:疱疹标本明显高于咽拭标本,荧光定量PCR明显高于RT-PCR。结论该市各县(市、区)全年均不同程度出现以CA16和EV71型为主的手足口病流行,5-7月应重点加强对全市托幼机构手足口病的防控;建议采用以采集疱疹液为主、咽拭子为辅,用荧光定量PCR进行核酸检测的检测方案。     

2012～2013年杭州市萧山区手足口病病原谱及临床特征分析

目的：了解杭州市萧山区手足口病（H FM D ）病原谱及临床特征。方法采用荧光定量反转录聚合酶链反应,对2012年5月至2013年7月就诊的208例H FM D疑似患儿咽拭子标本（45份）和粪便标本（208份）进行病原体检测,结合患儿临床资料分析检测结果。结果208例患儿中,肠道病毒（EV ）检出率为83．17％,其中EV71、柯萨奇病毒A16（CoxA16）和其他EV亚型所占比例分别为55．49％、13．29％和31．21％;男、女性患儿EV检出率比较差异无统计学意义（P＞0．05）。5岁及其以下患儿以EV71感染为主,5岁以上患儿以其他EV亚型感染为主。HFMD患儿临床症状主要为发热伴疱疹,各种类型临床症状患儿均以EV71感染为主。粪便标本EV检出率高于咽拭子标本（P＜0．05）。结论 EV71和其他EV亚型是该地区 HFMD患儿常见病原体,CoxA16感染流行趋势有所下降。加强EV、EV71和CoxA16检测有助于 HFMD的预防和控制。     

胶体金免疫法对手足口病分型检测的研究

目的 建立胶体金免疫法(CGIA)对手足口病(HFMD)分型的检测方法.方法 用双抗体夹心检测原理建立CGIA对HFMD分型检测方法,分别检测136例HFMD患儿和30例健康儿童粪便中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠病毒71型(EV71),以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为金标准,评价CGIA检测性能.结果 CGIA 与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27.2%和28.6%;CGIA与RT-PCR检测136例手足口病患儿粪便CA16阳性率分别为33.8%和35.3%;以RT-PCR为金标准,CGIA检测手足口病患儿粪便EV71的敏感性89.7%,特异性89.7%,阳性预测值94.5%,阴性预测值95.9%,准确度95.5%;CGIA检测手足口病患儿粪便CA16的敏感性85.4%,特异性94.3%,阳性预测值89.1%,阴性预测值92.2%,准确度91.1%.结论 CGIA法操作简单、方便、快速,特异性和敏感性好,为HFMD病原学早期分型诊断提供了一个有效的检测手段.     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析

目的 调查手足口病患者中EV71和CA16的感染现状,分析呼吸道病毒合并感染对患者的影响.方法 收集2010年6-10月在北京佑安医院就诊的手足口病患者348例,包括门诊轻症患者100例,住院患者248例.采集患者咽拭子标本提取病毒RNA,用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,荧光PCR法检测EV71和CA16.以呼吸道病毒多重PCR引物扩增12种呼吸道病毒的基因片段,通过电泳分析判断结果.比较EV71(+)或CA16(+)组与EV71(-)CA16(-)组合并呼吸道病毒感染阳性率和重症患者比例,住院与门诊手足口病患者中合并感染呼吸道病毒的阳性率.结果 348例手足口病患者,共检测出呼吸道病毒感染36例.在248例住院手足口病患者中,111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率7.2%,相比137例EV71(-)CA16(-)组患者呼吸道病毒感染率7.4%,差异无统计学意义(x2=0.059,P＞0.05).在100例门诊轻症手足口病患者中,有17例(17%)合并呼吸道病毒感染,高于111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率,差异有统计学意义(x2=4.830,P＜0.05).在111例EV71(+)或CA16(+)组中,重症患者为101例(91.0%);在137例EV71(-)CA16(-)组中,重症患者为132例(96.4%),两组重症患者率差异无统计学意义(x2=3.099,P＞0.05).在348份标本中检出占前3位的呼吸道病毒分别是人鼻病毒A/B(HRV A/B)、人副流感病毒3(PIV3)、甲型流感病毒(FLU A).结论 手足口病患者中存在呼吸道病毒合并感染,但合并感染对手足口病病情未见明显影响.     

436例手足口病监测病例病原检测结果分析

目的 对江西省赣州市2012年的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)监测病例进行病原检测分析,为制定疾病预防控制措施提供实验室参数.方法 采用Real Time RT-PCR法进行肠道病毒通用核酸(PE)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)特异性核酸检测.并统计HFMD的感染类型及其年龄、性别、地域及发病季节分布情况.结果 疱疹液、肛拭子、咽拭子的HFMD的检出率分别为100.00％、86.31％、73.80％,三者差异有统计学意义(x2=21.48,P＜0.01).咽拭子、肛拭子和疱疹液对EV71和CoxA16基因型总检出率分别为52.67％、58.66％和86.67％,三者差异有统计学意义(x2=8.33,P＜0.05).HFMD监测病例数轻型感染占82.83％、重型感染占15.54％,以EV71感染为主(44.92％).4岁及以下病例占90.49％(390/431);男女比例2.11∶1(296/140);发病地域居于前三位的依次为南康市(14.22％)、赣县(13.76％)和寻乌县(12.84％)；在5月和10月份发病最多(均为14.51％,62/427),其次为9月份(13.58％,58/427).结论 2012年赣州地区儿童HFMD监测病例以EV71感染为主,且多为轻型,南康市、赣县和寻乌县所占比例较高.