乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

大蒜新素对小鼠脾细胞Th1/Th2类细胞因子表达的影响

目的 :探讨大蒜新素 (即大蒜素注射液 )对正常BALB c小鼠脾细胞Th1 Th2 类细胞因子表达的影响。方法 :BALB c小鼠被随机分成大蒜新素处理组和生理盐水对照组 ,用双抗体夹心ELISA法检测小鼠脾细胞Th1 类细胞因子IL - 2 ,IFN -γ和Th2 类细胞因子IL - 4 ,IL - 10表达水平。结果 :大蒜新素能诱导正常BALB c小鼠脾细胞Th1 类细胞因子IL - 2和IFN -γ的表达显著增加 (P <0 0 1) ,Th2 类细胞因子IL - 10表达明显下降(P <0 0 1) ,而对I- 4的表达无明显影响 (P >0 0 5 )。结论 :大蒜新素明显抑制IL - 10的表达 ,以解除IL - 10对Th1 细胞分化的负性调节作用是其上调Th1 类细胞因子表达 ,增强特异性细胞免疫反应而发挥抗细胞内病原微生物感染效应的机制之一。     

口服Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达

目的：检测Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达,探索口服疫苗在肠道局部的摄取方式。方法：将C57BL/6小鼠随机分为2组,即生理盐水组和脂质体包裹重组质粒组。分别将生理盐水和脂质体包裹pCDNA3.1＋/Ag85A以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14 d,末次免疫后14 d处死小鼠,取肠,用免疫荧光方法检测Ag85A在肠道局部M细胞的表达。结果：Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道局部M细胞有表达。结论：口服脂质体包裹的DNA疫苗可以被肠道M细胞摄取。     

小鼠内源性抗原提呈树突状细胞疫苗的抗瘤作用

目的：将pcDNA3-hCEA真核表达质粒和肿瘤来源的RNA分别转染小鼠骨髓树突状细胞（dendritic cell,DC），观察内源性抗原提DC疫苗诱导BALB／C小鼠对CT26－hCEA^ 的抗肿瘤免疫效应。方法：采用细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4诱导培养法制备小鼠骨髓DC，利用Lipofectamine将pcDNA3-hCEA和肿瘤来源的RNA分别转染DC，制备能够内源性表达CEA的DC疫苗。使用DC疫苗预防免疫BALA／C小鼠，观察其对于荷CT26－hCEA^ 小鼠的抗肿瘤效应。结果：内源性抗原提呈DC疫苗明显延长荷CT26－hCEA^ 瘤小鼠生存期；与其他方法制备的DC疫苗相比，有较强的针对性抗肿瘤免疫效应和较长的持续效应。结论:地于免疫逃逸的肿瘤，内源性抗原提呈DC疫苗更具有免疫预防效应。     

气道嗜酸性粒细胞呈递抗原对Th1/Th2细胞分化的影响

目的 探讨嗜酸粒细胞(EOS)呈递抗原在体内和体外对Th1／Th2细胞分化的影响。方法 以鸡卵清蛋白抗原致敏和雾化吸入刺激BALB／c小鼠以诱发EOS在气道聚集后将其分离纯化。将曾在气道接触抗原的EOS和致敏CD4^ T细胞在体外共同培养,在部分实验中加入抗CD80或／和CD86单克隆抗体;同时,将EOS注入致敏小鼠气道,部分小鼠还接受抗CD80或／和CD86单克隆抗体静脉注射,然后在预定的时间收集气管旁淋巴结细胞进行培养。应用ELISA方法测定培养上清液中白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-13以及γ-干扰素(IFN-γ)的含量。结果 在和EOS体外共同培养的条件下,CD4^ 细胞产生较大量的IL-4、IL-5、IL-13等Th2类细胞因子,而产生的Th1类细胞因子IFN-γ的量相当低。抗CD80或／和抗CD86单抗可以明显地抑制Th2类细胞因子的产生。在体内实验中,接受EOS气管注入的小鼠引流淋巴结细胞主要被激发产生IL-4、IL-5和IL-13。在体外较短时间的培养过程中加入外原性OVA抗原后所产生的Th2类细胞因子的量更高。和体外实验结果相类似,抗CD80或／和抗CD86单抗同样可以明显地抑制EOS在体内的抗原呈递过程。结论 EOS无论在体内还是体外均能摄取和处理抗原,然后激发Th2反应.提示EOS不仅作为终末效应细胞,还可以通过强化Th2细胞的活性在变应性炎症的发生发展过程中具有放大作用。     

可溶性虫卵抗原对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及Th17细胞分化的影响

目的:探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)致敏小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对其细胞表型及Th17细胞分化的影响?方法:收集BALB/c小鼠骨髓细胞,应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)?白介素(interleukin,IL)-4定向诱导小鼠骨髓细胞向DCs分化;流式细胞仪检测SEA刺激培养后DCs表面分子的表达情况;流式细胞术检测DCs 分泌IL-6?IL-23的水平,ELISA法检测DCs分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的水平;SEA刺激DCs与CD4+T细胞共培养后检测培养上清中IL-6?TGF-β?IL-23和IL-17细胞因子水平?结果:诱导培养出可供实验用的高纯度DCs;SEA刺激DCs能表达较高水平的CD80?CD86?CD40?组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ类分子;SEA刺激DCs产生IL-6和TGF-β明显增多;SEA刺激的共培养细胞上清中IL-17水平增高?结论:SEA能够促进DCs成熟,并诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化?     

胃癌gp96多肽复合物树突状细胞疫苗对Th1/Th2平衡的影响

目的探讨gp96多肽复合物树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗对Th1/Th2平衡的影响.方法从胃癌组织中提取gp96多肽复合物负载从外周血单个核细胞诱导培养的DCs,用gp96多肽复合物DC疫苗诱导同一患者Th0淋巴细胞,ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-10的水平;以胃癌细胞裂解物负载的DC疫苗作对照.结果gp96多肽复合物DC疫苗诱导的T细胞分泌IFN-γ的量为(2 875±177.66)pg/ml,显著高于对照组(1 765±289.07)pg/ml(P＜0.01);分泌IL-10的量为(36±6.72)pg/ml,显著低于对照组(90±11.26)pg/ml(P＜0.05),二者之间存在显著的负相关(r=-0.915,P＜0.01).结论gp96多肽复合物DC疫苗可诱导Th1/Th2平衡向Th1漂移,显示了gp96多肽复合物DC疫苗可显著提高机体的免疫能力,为临床免疫干预治疗奠定基础.     

孕晚期小鼠巨噬细胞抗原递呈功能对Th1/Th2免疫的影响

目的 探讨孕晚期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞抗原提呈功能与母体Th2＞Th1免疫偏倚的关系.方法 选取孕晚期Balb/c小鼠作为研究对象,以动情期小鼠为对照.将Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞经抗原激发后作为抗原递呈细胞(APC),一部分(1°APC)用于致敏小鼠T细胞,然后分离致敏T细胞,再将另一部分巨噬细胞(2°APC)与致敏T细胞混合培养.采用淋巴细胞抗原特异性转化实验检验孕晚期小鼠脾脏巨噬细胞抗原提呈功能的改变,采用流式细胞技术检测CD4、CD8、IL-10和IFN-γ在反应后T细胞上的表达. 结果以孕晚期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞作为1°APC致敏动情期小鼠,再以孕晚期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞作为2°APC体外诱导致敏T细胞增殖的强度与对照组作为2°APC比较,差异无统计学意义(P＞0.05);以动情期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞作为1°APC,再以孕晚期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞作为2°APC诱导致敏T细胞增殖的强度则低于对照组作为2°APC时的增殖强度(P＜0.05).孕晚期小鼠脾脏巨噬细胞作为2°APC可诱导更多IL-10 T细胞产生(P＜0.05);IFN-γ T细胞的比例与1°或2°APC的类型无关. 结论孕晚期Balb/c小鼠脾脏巨噬细胞不是一种有效的APC细胞,可诱导孕期母体的Th2型免疫,并使Th1型免疫维持一定水平,对正常妊娠具有重要意义.     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

抗原负载的树突状细胞疫苗与肿瘤免疫治疗

<正> 免疫识别与免疫逃避是恶性肿瘤发病机理及防治中的关键矛盾,它决定着免疫反应的有无和强弱。在重建免疫识别的方法中,树突状细胞(Dendritic clells,DC)负载肿瘤相关抗原已经成为肿瘤治疗研究的热点。 树突状细胞的生物学特性 1 DC的来源及分类 Steinman和Cohn1973年从小鼠脾脏中分离出来一种新型细胞,根据其最初从淋巴器官分离,且具有树状突起而被     

异种化PSCA融合基因抗前列腺癌DNA疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的DNA疫苗（pVAX1-PSCA3-Fc—GPI—IRES—GM／B7,简称pVAX1—PSCA3FcGB）,并在Cos7细胞中表达。方法：重叠延伸PCR合成异种化PSCA基因片段,同尾酶法将该片段3拷贝串联（PSCA,）后插入pCI—Fc—GPI载体中,再将PSCA3-Fc—GPI融合基因片段经酶切后导人真核表达载体pVAX1-IRES—GM／B7中,构建pVAX1-PSCA3FcGB疫苗,并检测其真核表达情况。结果：经测序异种化PSCA片段与设计一致,PCR和酶切鉴定证明pVAX1-PSCA3FcGB构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪检测结果显示,该疫苗在Cos7细胞中获得较好表达。结论：成功构建DNA疫苗pVAX1-PSCA3FcGB,并在Cos7细胞中有效表达,为下一步的DNA疫苗功能研究奠定了重要基础。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达

目的构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况。方法首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Survivin及hCGβ-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆入基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒。接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达。结论成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础。     

变应原疫苗对变态反应性鼻炎患者血清中Th细胞漂移的临床研究

目的:观察变应原疫苗(商品名阿罗格,简称NHD)对变态反应性鼻炎患者血清中Th1、Th2细胞水平的影响。方法:3年期间收集30位变应性鼻炎患者,15例(A组)根据变应原进行特异性免疫治疗,15例(B组)仅鼻用糖皮质激素,观察治疗前后的临床疗效及免疫学标志白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-13(IL-13)的变化情况。结果:A组(特异性免疫治疗组)有效率91.83%,B组(鼻用糖皮质激素组)有效率89.67%。A组变应性鼻炎患者在经NHD治疗后血清Th1细胞因子IL-2含量显著增高,而Th2细胞因子IL-13含量显著减少,治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。B组IL-2、IL-13含量治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。结论:特异性免疫治疗是治疗变应性鼻炎的有效方法。用NHD特异性免疫治疗能通过对变应性鼻炎患者血中Th1/Th2细胞产生的细胞因子IL-2、IL-13比例的平衡,来纠正Th1/Th2细胞失平衡,能明显改善患者的临床症状,Th1/Th2平衡假说得到初步证实。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原(mPSCA)基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

老年特应性皮炎患者外周血Th1、Th2、Th17细胞与鳞状上皮细胞癌抗原水平的变化及意义

目的 探究外周血辅助性T细胞Th1、Th2、Th17和鳞状细胞癌抗原（SCCA）水平在老年特应性皮炎患者中的变化及其意义。方法 以2022年3月—2022年7月于四川省人民医院皮肤科就诊的25例老年特应性皮炎患者（老年特应性皮炎组）及同期33例健康体检者（健康对照组）为研究对象。采取流式细胞术测定外周血Th1、Th2和Th17细胞占CD4⁺T细胞的比例;检测老年特应性皮炎患者的外周血嗜酸性粒细胞（EOS）计数、总免疫球蛋白E（IgE）及血清SCCA水平;采用Spearman法进行相关性分析。结果 老年特应性皮炎患者皮损严重且分布广泛,主要表现为四肢伸侧及背部苔藓样湿疹,部分患者有1种或多种系统性疾病。老年特应性皮炎组的外周血EOS计数较健康对照组明显增加（P <0.05）。老年特应性皮炎组外周血中Th2和Th17细胞比例均高于健康对照组（P <0.05）,而Th1细胞比例与健康对照组比较,差异无统计学意义（P >0.05）。老年特应性皮炎组外周血EOS计数与Th2细胞比例、SCCA水平有相关性（r_s =-0.399和0.607,均P <0.05）。老年特应性皮炎患者的SCCA水平与SCORAD评分呈正相关（r_s =0.416,P <0.05）。结论 老年特应性皮炎患者具有特有的临床特征,以Th2和Th17型炎症为主。老年特应性皮炎患者血清SCCA水平可在一定程度上反映其疾病的严重程度。     

密码子优化对乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影响

目的:观察密码子优化能否增强乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性.方法:根据乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原中蛋白(MHBs)的氨基酸序列,在不改变其氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了密码子优化的基因,并将该基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891中,构建了密码子优化的表达MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr/opt,简称opt).用上述核酸疫苗与表达野生型MHBs核酸疫苗(命名为:pSW3891/MHBs/adr,简称adr)及空载体质粒pSW3891一起瞬时转染293T细胞,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中MHBs的表达.采用肌肉注射法,以opt、adr及pSW3891,分别对BALB/c小鼠进行免疫.用EIJSA方法检测免疫后小鼠血清中HBs抗体的滴度,ELISPOT法检测免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞.结果:opl和adr均可在体外293T细胞中高效表达,且opt的蛋白表达量要高于野生型.opt免疫组小鼠特异性抗体滴度和免疫小鼠表面抗原特异性分泌IFN-γ脾细胞数量都要显著的高于adr免疫组小鼠.结论:密码子优化可以增强乙型肝炎病毒DNA疫苗在体外的蛋白表达量及免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫原性.     

接种纯化人用狂犬病疫苗对妊娠期Th1/Th2类细胞因子谱的影响

目的研究人用狂犬病纯化疫苗(RV)对妊娠期Th1/Th2类细胞因子谱的影响。方法对所有可疑狂犬病毒暴露者进行RV的全程接种,在接种RV的第0、14、45天时采血并分离外周血单个核细胞与RV进行培养,采用ELISA法检测抗狂犬病病毒抗体,体外培养检测淋巴细胞增殖能力,CBA法检测细胞培养上清液中Th1类细胞因子:干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-2(IL-2)以及Th2类细胞因子:IL-4、IL-5、IL-10的水平。结果 17例暴露者于RV全程注射后17d(第45天)抗体检测阳性;RV刺激后,暴露者第45天淋巴细胞增殖能力明显高于第0天(P<0.05);当RV刺激后,暴露组第14天、第45天产生IL-2、IL-4、IL-5的含量显著高于未刺激组及暴露组第0天水平(P<0.05)。结论妊娠期注射RV在刺激机体产生体液免疫的同时,可以有效地诱导Th1/Th2类细胞因子的产生。