皮肤科学基础

20121801过表达p53基因和中波紫外线照射对人皮肤成纤维细胞衰老的影响/陈文琦(南京医大附一院皮科),毕志刚,许惠娟…∥中国皮肤性病学杂志.-2012,26(6).-486～489建立稳定过表达野生型p53基因(wtp53)的人皮肤成纤维细胞系,探讨过表达p53基因及中波紫外线(UVB)照射对人皮肤成纤维细胞(HSF)衰老的影响。在脂质体lipofectamineTM2000介导下,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立转染克隆细胞系。用RT-PCR,     

RNA干扰p53基因表达对人皮肤成纤维细胞衰老的影响

目的 建立抑制p53基因表达的人皮肤成纤维细胞（HSF）,探讨抑制p53表达对HSF衰老的影响。方法 脂质体转染法将针对p53的shRNA的真核表达质粒pGCsi-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立稳定转染克隆细胞系。用RT-PCR、实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。通过SA β-gal染色法检测细胞衰老,MTT法检测细胞增殖能力。 结果 成功建立RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,转染细胞中p53基因及蛋白水平明显下调（P < 0.01）。SA β-gal染色结果显示,转染组衰老细胞百分比（13.47% ± 1.01%）与对照组（18.10% ± 0.66%）相比降低（P < 0.05）,MTT检测结果显示,转染组细胞增殖能力较对照组加快（P < 0.05）。结论 抑制p53表达能够延迟HSF的衰老,促进细胞增殖。     

RNA干扰p53基因对中波紫外线诱导的早衰和光致癌相关基因表达的影响

【摘要】 目的 探讨RNA干扰p53基因对中波紫外线（UVB）诱导的人皮肤成纤维细胞（HSF）早衰和光致癌相关基因表达的影响。 方法　利用已构建成功的RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,加以反复多次亚毒性剂量UVB照射,衰老相关的β半乳糖苷酶（SA β-gal）染色法检测细胞衰老,定制实时定量PCR芯片,检测多种光致癌发生相关基因的表达,包括：参与细胞衰老通路的p53、p21、p19、p16、pRb,衰老相关基因纤维结合素（FN）、骨结合素（ON）、平滑肌22（SM22）,p53依赖的细胞凋亡相关基因bax和bcl-2,UVB诱导的癌基因缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）以及负性调控p53的人双微球蛋白2基因（hdm2）。使用SPSS10.0软件对各组间数据进行配对t检验。 结果　抑制p53表达的HSF经UVB照射后SA β-gal活性（19.70% ± 0.85%）较照射前（12.77% ± 0.81%）有所增加（t = 6.45,P ＜ 0.05）,但显著低于正常HSF经UVB照射后（50.48% ± 5.30%,t = 7.86,P < 0.05）,与正常HSF组（18.50% ± 0.45%）差异无统计学意义（t = 2.57,P > 0.05）。基因检测结果表明,抑制p53表达可抑制衰老基因p21、p19、FN、ON、SM22等的表达,但p16通路并不受之影响,在UVB作用下,p16、pRb的表达显著增加,分别上调。抑制p53的表达可使抑凋亡基因bcl-2上调及促凋亡基因bax下调,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表达明显增加。UVB照射对这些基因表达改变无明显影响。 结论　抑制p53表达能够延缓UVB诱导的早衰。UVB诱导的早衰具有p53依赖的相关肿瘤抑制作用。     

柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线照射后体外培养人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及机制研究

目的：研究柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线（UVB）照射后体外培养人皮肤成纤维细胞（HSF）衰老的保护作用及衰老相关基因p53、p21、微RNA(miR)-34c和沉默信息相关调节因子（SIRT）1 mRNA表达水平的影响。方法：取对数生长期的HSF，分为对照组、UVB照射组，柴达木黑果枸杞花青素低剂量组（0.1 g/L）、柴达木黑果枸杞花青素中剂量组（0.5 g/L）和柴达木黑果枸杞花青素高剂量组（1.0 g/L）。UVB照射前24 h用不同浓度的柴达木黑果枸杞花青素预处理HSF。UVB照射后72 h,β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法检测衰老细胞比例，定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测细胞中衰老相关基因p53、p21、miR-34c及SIRT1 mRNA的表达水平。结果：与对照组相比，UVB照射组细胞SA-β-gal染色阳性率及p53、p21、miR-34c和SIRT1 mRNA表达水平均升高（P<0.05）。与UVB照射组相比，柴达木黑果枸杞花青素（0.1 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L）组细胞SA-β-gal染色阳性率，p53、p21、miR-3...     

UVB照射诱导皮肤成纤维细胞早期衰老的研究

目的 探讨UVB诱导的细胞衰老与肿瘤发生的关系。方法 噻唑蓝（MTT）法检测UVB辐射后的细胞增殖情况,筛选诱导衰老适宜的亚毒性剂量和照射次数。染色法检测衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA β-gal）活性。RT－PCR检测衰老相关基因纤维结合素（FN）、骨结合素（ON）和平滑肌22（SM22）的表达。结果 以10 mJ/cm2的亚毒性剂量连续5次照射人成纤维细胞后,衰老的生物学特征得以明显表现：①MTT法检测显示细胞增生能力的减弱。②照射组具有SA β-gal活性的阳性细胞明显增加,照射组和对照组的阳性率分别为82.0%和33.7%（P < 0.01）。③3种衰老相关基因FN、ON和SM22的表达亦明显增强,分别约为对照组细胞的2.7、2.0、2.3倍（P < 0.05）。结论 反复亚毒性剂量UVB照射人成纤维细胞,初步建立一种UVB诱导的应激诱导的早期衰老（SIPS）模型。     

p53相关的细胞周期调控在UVB诱导的皮肤成纤维细胞早衰中的作用

目的探讨中波紫外线(UVB)诱导皮肤成纤维细胞(HSF)应激诱导的早衰(SIPS)后细胞周期调控的变化。探讨p53相关的生长停滞、细胞凋亡相关基因表达在UVB诱导的SIPS中的变化情况。方法对UVB诱导发生SIPS的HSF,流式细胞仪检测细胞周期;Western blot法检测衰老信号通路中p53,p21,p16的表达;实时荧光定量PCR芯片检测与p53相关的生长停滞(p53,p21,p16,p19)、凋亡(bax,bcl-2)基因的mRNA表达水平。结果流式细胞仪对UVB诱导的SIPS模型进行细胞周期检测发现,大部分细胞发生了G1期阻滞;衰老通路中p53,p21和p16的表达都明显增加;实时荧光定量PCR芯片检测发现,与生长停滞相关的抑癌基因p53,p21,p16,p19的表达均上调;p53下游的凋亡相关基因中的抑凋亡基因bcl-2表达稍上调,而凋亡基因bax表达下调。结论G1期阻滞和衰老信号通路蛋白表达增加进一步印证了UVB诱导HSF发生的SIPS。p53信号通路相关基因的表达变化提示UVB诱导的SIPS可能具有与p53相关的抗凋亡作用,但其中p53信号通路所起的作用还需更进一步的实验探索。     

EGCG对中波紫外线诱导HaCaT细胞p53基因和蛋白表达的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)照射诱导永生化角质形成细胞株-HaCaT细胞的p53 mRNA和p53蛋白表达的影响。方法:以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,并以200μg/mL EGCG处理照射后的HaCaT细胞,分别用RT-PCR法和Western blot方法检测各处理条件下p53 mRNA和/或p53蛋白的表达水平。结果:30 mJ/cm2的UVB照射后HaCaT细胞的p53 mR-NA和p53蛋白表达逐渐增加,4 h达到峰值,4 h后随照射剂量增加而增加,24 h后有所恢复;加入EGCG可下调UVB诱导的表达作用。结论:UVB照射对HaCaT细胞p53 mRNA和p53蛋白的诱导表达有时效性与量效性,EGCG可下调UVB照射的这种诱导作用。     

p53蛋白在UVB诱导凋亡的富集表皮干细胞的角质形成细胞中的表达

目的研究p53蛋白在中波紫外线(ultraviolet lightB,UVB)诱导凋亡的富集表皮干细胞的角质形成细胞群中的表达情况。方法分离富集人表皮干细胞的角质形成细胞群和正常角质形成细胞群,使用UVB诱导两种细胞群凋亡,蛋白印迹法比较不同剂量UVB诱导前后两组细胞的p53蛋白表达的差异。结果两种细胞在不同剂量的UVB照射后p53蛋白表达均比照射前显著增加,在20mJ/cm2与40mJ/cm2照射剂量时,富集人表皮干细胞的角质形成细胞群p53蛋白表达高于正常角质形成的细胞群,差异有统计学意义(P<0.05)。结论富集人表皮干细胞的角质形成细胞p53蛋白表达比其它角质形成细胞对中波紫外线的照射易感。     

芒果苷抑制中波紫外线诱导人成纤维细胞提前衰老的相关研究

【摘要】 目的 研究芒果苷是否对反复亚毒性剂量中波紫外线（UVB）诱导的人二倍体成纤维细胞的早衰起抑制作用及其可能的机制。 方法 实验分成空白对照组（不做处理）,UVB-应激诱导的提前衰老（SIPS）组（单纯照光）,芒果苷4.0 mg/L组（单纯加药）,UVB + 芒果苷1.0 mg/L组、UVB + 芒果苷2.0 mg/L组、UVB + 芒果苷4.0 mg/L组（UVB照射联合药物处理）。成纤维细胞经5次UVB 10 mJ/cm2照射后,用细胞计数法（CCK8法）检测细胞增殖活性,β半乳糖苷酶染色（SA-β-Ga1）计算衰老细胞百分比,流式细胞仪测定细胞周期,蛋白印迹检测衰老相关蛋白p53、p21、p16含量,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测基质金属蛋白酶1（MMP1）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和衰老相关基因p53、p21、p16 mRNA表达。采用单因素方差分析进行数据统计分析。 结果 UVB + 芒果苷1.0 mg/L组、UVB + 芒果苷2.0 mg/L组、UVB + 芒果苷4.0 mg/L组以及UVB-SIPS组细胞增殖活性（A450）依次为0.322 9 ± 0.011 3、0.336 1 ± 0.016 3、0.342 6 ± 0.014 4、0.288 2 ± 0.020 7（F = 110.08,P < 0.05）,β半乳糖苷酶染色阳性率依次为（88.83 ± 4.54）%、（46.33 ± 5.51）%、（32.17 ± 6.05）%、（93.67 ± 3.75）%（F = 283.54,P < 0.05;与UVB-SIPS组比较,除UVB + 芒果苷1.0 mg/L组外,其他两组均P < 0.05）;G1期细胞阻滞率依次为（72.19 ± 3.42）%、（60.99 ± 2.70）%、（49.80 ± 2.10）%、（82.09 ± 0.89）%（F = 156.01,P < 0.05）。与UVB-SIPS组相比,UVB + 各浓度芒果苷组细胞MMP1和MMP3 mRNA表达降低（F = 69.41、106.41,均P < 0.05）,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达增加（F = 66.41、46.81,除UVB + 芒果苷1.0 mg/L组P > 0.05外,其他各组均P < 0.05）,衰老相关基因p53、p21、p16 mRNA表达降低（F = 265.60、151.82、329.85,均P < 0.05）,衰老相关蛋白p53、p21和p16的合成减少（F = 160.51、158.53、75.38,均P < 0.05）,各指标检测值的变化与芒果苷浓度之间呈一定依赖性。 结论 芒果苷可能通过下调p53、p21、p16基因的表达来抑制UVB诱导的人二倍体成纤维细胞的早衰。     

水通道蛋白3通过调控hnRNPQ/p53延缓皮肤成纤维细胞光老化的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）在皮肤光老化过程中的作用及机制。方法 将正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）分为NHDF组（未转染）、AQP3 cDNA组（转染AQP3 cDNA）、AQP3 siRNA组（转染AQP3 siRNA）、核内不均一核糖核蛋白Q（hnRNPQ）cDNA组（转染hnRNPQ cDNA）、hnRNPQ siRNA组（转染hnRNPQ siRNA）、AQP3-hnRNPQ cDNA组（转染AQP3 cDNA和hnRNPQ cDNA）、AQP3-hnRNPQ siRNA组（转染AQP3和hnRNPQ siRNA）、cDNA空载体组（转染cDNA空载体）、siRNA空载体组（转染siRNA空载体）。用长波紫外线（UVA,10 J·cm-2·d-1）连续照射已经转染或未转染的NHDF 3 d来建立细胞衰老模型,同时以未接受UVA照射的NHDF作为对照。用细胞计数法评估各实验组细胞增殖活性,衰老相关-β半乳糖苷酶染色试剂盒对各实验组进行染色来评估HDF的衰老水平,用荧光素酶报告基因技术检测p53转录调控活性,用Western印迹分析NHDF中AQP3、hnRNPQ及衰老相关蛋白p53、p21的表达水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用ANOVA检验。结果 用UVA连续照射各组NHDF 3 d后,NHDF中p53、p21的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率明显高于未照射的对照组（P＜0.05）,但是AQP3的表达水平和照射后第5、6、7天细胞增殖活性明显低于对照组（P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,AQP3 siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型较siRNA空载体组明显加重,两组间p53、p21、hnRNPQ的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性、细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步沉默hnRNPQ能够逆转上述反应。与siRNA空载体组相比,hnRNPQ siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显减轻,两组间p53、p21表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,cDNA空载体组中p53、p21、hnRNPQ的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为0.56 ± 0.08、0.70 ± 0.07、0.92 ± 0.03、（81.53 ± 7.62）%、7.16 ± 0.25、（2.15 ± 0.23） × 106/ml,而AQP3 cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显轻于cDNA空载体组,其上述指标分别为0.25 ± 0.06、0.23 ± 0.06、0.82 ± 0.09、（31.23 ± 6.54）%、2.52 ± 0.36、（2.93 ± 0.33） × 106/ml,两组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步过表达hnRNPQ能够逆转上述效应。在接受UVA连续照射3 d后,hnRNPQ cDNA组中p53、p21的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为1.41 ± 0.09、1.42 ± 0.06、（91.06 ± 4.24）%、12.35 ± 0.88、（1.23 ± 0.41） × 106/ml,与cDNA空载体组相比,hnRNPQ cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显加重,两组比较,上述指标差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 AQP3可能通过调控hnRNPQ下调p53的表达来减缓UVA诱导的NHDF衰老。     

UVB诱导人皮肤成纤维细胞的氧化应激损伤研究

目的 观察人皮肤成纤维细胞被UVB照射后的光损伤、凋亡、周期阻滞和氧化应激损伤状态,并检测氧化应激的相关信号蛋白p66Shc的表达情况。方法 用小剂量UVB多次照射培养的人皮肤成纤维细胞,以细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色法观察细胞衰老状态,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量,并以Western印迹法检测p66Shc蛋白的表达。结果 SA-β-Gal染色显示,培养的人皮肤成纤维细胞在UVB照射后呈强阳性染色;细胞凋亡率在未照射的对照组为0.96％,UVB照射组为37％;而细胞周期检测显示,经UVB照射的人皮肤成纤维细胞大部分阻滞于G0/G1期（80.07%）。细胞内超氧化物歧化酶水平对照组为（52.35 ± 4.97） ng/g蛋白,UVB照射组为（7.81 ± 0.68） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.01）;而丙二醛水平两组分别为（3.52 ± 0.34） ng/g蛋白和（33.91 ± 3.20） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.05）。人皮肤成纤维细胞经UVB照射诱导后24 h,p66Shc呈弱阳性表达,48 h后表达进一步增强。结论 培养的人皮肤成纤维细胞经UVB照射后进入氧化应激增强状态。p66Shc蛋白在此过程中表达逐渐增强。     

Tiron protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblasts by the inhibition of superoxide anion production and glutathione depletion

Background/Objectives: Free radicals and reactive oxygen species (ROS), which are generated by UV irradiation, may induce an irreversible growth arrest similar to senescence. Tiron, 4,5-dihydroxy-1,3-benzene disulfonic acid, is a widely used antioxidant to rescue ROS-evoked cell death. The aim of the article was to explore the effects of tiron on skin photoaging and associated mechanisms. Methods: The effects of tiron on cell proliferation were determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-Yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Senescent cells were determined by morphology and senescence-associated β-galactosidase activity analysis. Intracellular hydrogen peroxide, superoxide anion and glutathione concentration were analysed by a fluorescent probe. The concomitant changes of protein expression were analysed with Western blot. Results: Human dermal fibroblasts were induced to premature senescence by sub-cytotoxic doses of irradiated UVB. Strong senescence-associated β-galactosidase activity and increased intracellular superoxide anion were observed in human dermal fibroblasts irradiated by UVB. Tiron blocks UVB-induced glutathione depletion and increase of superoxide anion and protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblasts. Compared with normal fibroblasts, UVB-irradiated human dermal fibroblasts showed a higher ratio of active (hypophosphorylated) to inactive (phosphorylated) forms of Rb and p38, upregulation of p53 or p16 and c-Myc and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) downregulation. After treatment with tiron, p53, p16 c-Myc and IGF-1 as well as phosphorylation Rb and p38 could partially recover. Conclusion: These results indicate that tiron protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblasts via the inhibition of production of superoxide anion and glutathione depletion, and modulation of related senescence proteins.     

人参皂苷和枸杞多糖对UVB诱导培养的成纤维细胞提早衰老的影响

目的 用重复亚毒性剂量UVB辐射培养的皮肤成纤维细胞,观察衰老相关的生物学标志的表达情况,并研究人参皂苷Rb1、Rg1和枸杞多糖对UVB诱导的提早衰老的影响,及对衰老相关的信号分子p16、p21和p53表达的影响。方法 给予培养的皮肤成纤维细胞10次、每次剂量为15 mJ/cm2的UVB辐射。用光镜观察细胞形态学改变,用透射电镜观察细胞超微结构,用β－半乳糖苷酶化学染色法检测衰老细胞,用流式细胞仪检测细胞周期,用RT-PCR检测p16、p21和p53 mRNA的表达水平。结果 三种中药单体对培养的成纤维细胞形态、β－半乳糖苷酶活性、细胞周期和p16、p21和p53 mRNA的表达均没有影响。UVB辐射后,细胞形态和超微结构发生改变;91.5%细胞β－半乳糖苷酶染色阳性;UVB辐射组的G1期细胞数（88.63% ± 4.67%）上升,与对照组（49.18% ± 5.53%）比较差异有统计学意义（P < 0.05）。UVB + 人参皂苷Rb1、UVB ＋ 人参皂苷Rg1、UVB ＋ 枸杞多糖组G1期细胞数分别为71.04% ± 1.64%、70.38% ± 2.58%、80.09% ± 3.46%,与UVB辐射组比较差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。与对照组比较,UVB辐射组的p16、p21和p53 mRNA的表达明显增加（P < 0.05）。与UVB辐射组比较,三种中药单体能明显抑制UVB辐射细胞的p16 mRNA的表达（P均 < 0.05）,人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1能明显抑制p21 mRNA的表达（P < 0.05）,人参皂苷Rb1和枸杞多糖能明显抑制p53 mRNA的表达（P < 0.05）。结论 人参皂苷Rb1、Rg1和枸杞多糖对UVB诱导培养的成纤维细胞提早衰老具有抑制作用,对p16、p21和p53 mRNA表达的下调作用是抑制作用的机制之一。     

沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤的影响

【摘要】 目的 探讨沉默miRNA-23a对UVB照射所致成纤维细胞慢性光损伤的影响。 方法 将成纤维细胞分为空白对照组、UVB光损伤组、miRNA-23a 沉默组、UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组。SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色测定老化程度,流式细胞仪检测细胞周期,实时PCR法检测p53、p16、p21 mRNA的表达,免疫印迹法检测p53、p16、p21的蛋白表达量。 结果 UVB光损伤组与UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的SA-β-Gal细胞蓝染阳性率分别为（94.60 ± 2.58）%、（48.18 ± 3.70）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。G1期阻滞率分别为（85.06 ± 1.52）%、（57.48 ± 2.01）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量与UVB光损伤组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞衰老有抑制作用,而miRNA-23a对下游衰老相关信号分子的抑制可能是其机制之一。     

SV40T抗原基因转染正常人黑素细胞的研究

目的 研究SV40T抗原基因对体外培养的人正常黑素细胞的转化作用。方法 用阳离子聚合物Sofast^TM介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体SV40T-pEGFP导入原代培养的正常人黑素细胞进行稳定表达,G418筛选出阳性克隆,挑独立的单克隆扩大培养,检测SV40T抗原基因及SV40T蛋白在黑素细胞内的表达。结果 分离获得转化细胞阳性克隆。提取DNA及RNA后用PCR法成功扩增出288bp的片段,免疫组化及蛋白质印迹结果证实,转染黑素细胞核内有SV40T蛋白表达。结论 SV40T抗原基因可以成功诱导人黑素细胞的转化。