人乳腺癌MCF—7细胞凋亡过程中p53与bcl—2表达的时序性

目的：研究细胞凋亡过程中ｐ５３与ｂｃｌ－２基因表达变化的时序关系，以探索ｐ５３调控ｂｃｌ－２的可能性。方法：选择具有野生型ｐ５３的人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系，用５－Ｆｕ为诱导剂诱导细胞凋亡；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测细胞凋亡过程中ｐ５３与ｂｃｌ－２表达变化的时序性。结果：ｐ５３表达增高出现在ｂｃｌ－２表达降低之前。结论：ｐ５３在时序上具有作为ｂｃｌ－２基因负调控转录因子的可能性     

前列腺癌p53、bcl-2、bax基因表达与凋亡、增殖的关系

目的:研究前列腺癌组织中细胞增殖与细胞凋亡,及其相关蛋白表达意义。方法:采用原位细胞凋亡标记技术(TUNEL)及免疫组织化学ABC法对36例前列腺癌(Pca)和11例正常前列腺(NP)组织石蜡切片p53、bcl鄄2、bax、PCNA蛋白及细胞凋亡检测。结果:前列腺癌细胞的增殖指数和细胞凋亡指数较NP明显增高,且AI/PI比值较正常组织AI/PI低(P<0.01);随着肿瘤分级的增加,细胞增殖水平明显增加(P<0.01)。p53蛋白表达与前列腺癌细胞增殖水平相关;bcl鄄2蛋白表达与细胞凋亡水平相关(P<0.05);bax基因表达与凋亡无关,但发现它们的bcl鄄2/bax的比值与凋亡有关。表明高bcl鄄2/bax比值多见于低凋亡组,低bcl鄄2/bax比值多见于高凋亡组。结论:细胞增殖与细胞凋亡均参与了前列腺癌的发生、发展。p53基因与细胞增殖水平的调控有关。bcl鄄2和bax在细胞凋亡调节中起到重要作用,由于bcl鄄2蛋白过量表达引起bcl鄄2/bax失平衡,在前列腺癌发生、发展过程中起到重要作用。     

紫杉醇诱导HL—60细胞凋亡的研究

目的：观察抗微管药紫杉醇对急性白血病细胞株HL－60是否具有凋亡诱导作用,并进一步研究bcl－2基因在此过程中的作用。方法：（1）以紫杉醇处理HL－60细胞,观察细胞生长抑制作用的时间效应和剂量效应,在光镜和电镜下观察细胞形态变化;（2）用流式细胞仪检测药物孵育前后细胞凋亡率（AP）的变化;（3）用RT－PCR法检测药物孵育前后bcl-2基因的表达水平。结果：（1）在一定剂量和时间范围内紫杉醇能抑制HL－60细胞生长;（2）紫杉醇能诱导HL－60细胞凋亡,并显示剂量效应：（3）在紫杉醇诱导HL－609细胞凋亡过程中,bcl－2基因表达水平下调。结论：紫杉醇能诱导HL－60细胞凋亡;bcl-2基因参与了紫杉醇诱导HL－60细胞凋亡的调控。     

鼻咽癌中p53、bcl-2、bax、Fas的表达及其相互关系的研究

目的　了解凋亡相关基因p53、bcl2、bax、Fas在鼻咽癌(NPC)中的表达及相互关系。方法　在67例NPC、15例癌旁组织中用免疫组化技术标记bcl2、p53、bax、Fas;用免疫双标记技术同时标记p53与bcl2;从中选取15例NPC用DNA原位杂交技术检测bcl2基因扩增情况。结果　①67例NPC中p53蛋白阳性38例(567%),bcl2蛋白阳性48例(716%),bax蛋白阳性28例(418%),Fas蛋白阳性29例(433%);②NPC中,p53蛋白与bcl2蛋白的阳性率显著高于癌旁组织,而bax蛋白与Fas蛋白的阳性率却显著低于癌旁组织;③p53蛋白与bcl2蛋白阳性表达间呈正相关。④bcl2/bcl2同二聚体在NPC中占优势;p53蛋白表达在bcl2/bcl2同二聚体占优势的肿瘤中显著高于在bax/bax同二聚体占优势的肿瘤中。结论　①p53、bcl2、bax、Fas在NPC中有较高的阳性表达率,与NPC的发生、发展关系密切;②NPC中p53与bcl2蛋白表达呈正相关,提示NPC中p53蛋白主要不是突变型,有异于其它肿瘤。③抑制细胞凋亡的bcl2/bcl2同二聚体在NPC中占优势,尤其是在泡状核细胞癌中,提示其与NPC的发生及分化有关。     

重组人转化生长因子β1诱导人肝癌细胞SMMC—7721凋亡

用不同剂量的rhTGF－β1与人肝癌细胞SMMC－7721共同繁育不同时间后，用荧光显微镜进行形态学观察；提取细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳分析电泳条带；用流式细胞仪分析细胞周期变化；用免疫组化法检测bcl－2、c－myc基因表达的变化。结果显示：细胞经rhTGF－β1作用后体积缩小、核染色质固缩或成碎片状；细胞DNA电泳呈典型的“阶梯状”条带；细胞周期分析显示rhTGF－β1先使SMMC－7721细胞停滞在G0／G1期，继而诱发细胞产生凋亡；免疫组化检测发现rhTGF－β1可下调bcl－2和c－myc蛋白的表达。研究表明：rhTGF－β1诱导人肝癌细胞凋亡与G0／G1期阻滞密切相关；bcl－2、c－myc基因产物的下调在rhTGF－β1诱导的细胞凋亡过程中可能起重要的调控作用。     

胃粘膜上皮细胞系GES-1细胞凋亡密度依赖性的研究

目的：探讨细胞密度对GES－1细胞调亡的影响及其机制。方法：细胞凋亡的存在以Giemsa染色证实，bcl－2基因的表达采用细胞原位杂交技术。结果：正常培养情况下GES－1细胞凋亡呈细胞密度依赖性；8mg／L的五肽胃泌素能增强bcl－2基因的表达但不能抑制密度依赖的细胞凋亡。结论：bcl-2基因表达可能与GES-1细胞凋亡的密度依赖性无关。     

rhTNF—a联合bcl—2反义寡核苷酸对急性髓细胞白血病细胞株HL—60增殖与凋亡的作用

目的 探讨基因重组人类肿瘤坏死因子a（rhTNF-a）和bcl－2反义寡核苷酸（ASPO）对HL－60细胞增殖与凋亡的作用，进一步认识肿瘤坏死因子a（rhTNF-a）和bcl－2两者调控肿瘤细胞凋亡的作用及相互联系。方法 单独和联合应用rhTNF-a和bcl－2ASPO处理HL－60细胞，通过MTT法检测HL－60细胞生长和存活特性变化；原位细胞凋亡检测和流式细胞技术检测细胞凋亡；应用RT－PCR、免疫组织化学检测癌基因bcl－2表达的改变。结果 rhTNF-a和bcl－2ASPO的联合应用明显增强对HL－60细胞的增殖抑制；细胞凋亡率明显升高；癌基因bcl－2在mRNA和蛋白表达明显下降。结论 TNF和bcl－2ASPO在诱导HL－60细胞凋亡中可能存在协同作用，为血液肿瘤的联合治疗提供了新的途径。     

鼻咽癌中p53、bcl-2、bax、Fas的表达及其相互关系的研究

目的　了解凋亡相关基因 p53、bcl 2、bax、Fas在鼻咽癌 (NPC)中的表达及相互关系。方法　在 67例NPC、5例癌旁组织中用免疫组化技术标记bcl 2、p53、bax、Fas ;用免疫双标技术同时标记 p53与bcl 2 ;从中选取 15例NPC用DNA原位杂交技术检测bcl 2基因扩增情况。结果　① 67例NPC中 p53蛋白阳性 38例 (56 7% ) ,bcl 2蛋白阳性 4 8例(71 6% ) ,bax蛋白阳性 2 8例 (4 1 8% ) ,Fas蛋白阳性 2 9例 (4 3 3% )。②NPC中 ,p53蛋白与bcl 2蛋白的阳性率显著高于癌旁组织 ,而bax蛋白与Fas蛋白的阳性率却显著低于癌旁组织。③ p53蛋白与bcl 2蛋白阳性表达间呈正相关。④bcl 2 /bcl 2同二聚体在NPC中占优势 ;p53蛋白表达在bcl 2 /bcl 2同二聚体占优势的肿瘤中显著高于bax/bax同二聚体占优势的肿瘤中。结论　①p53、bcl 2、bax、Fas在NPC中有较高的阳性表达率 ,与NPC的发生、发展关系密切。②NPC中 p53与bcl 2蛋白表达呈正相关 ,提示NPC中 p53蛋白主要不是突变型 ,有异于其它肿瘤。③抑制细胞凋亡的bcl 2 /bcl 2同二聚体在NPC中占优势 ,尤其是泡状核细胞癌中。提示其与NPC的发生及分化有关。     

胃癌和肠化上皮组织微卫星不稳定性及bcl-2、erbB-2和p53蛋白表达的比较研究

目的：研究微卫星不稳定性（MSI）在胃癌发生中的作用及其与bcl－2、erbB－2和突变型p53蛋白表达的关系。方法：采用PCR－SSLP和免疫组织化学技术检测了50例手术切除胃癌和15例肠化组织标本的MSI和bcl－2、erbB－2及突变型p53蛋白表达。结果：胃癌MSI发生率为54％，肠化组织MSI发生率为20％，胃癌组织bcl－2、erbB、及p53蛋白阳性率分别为60％、22％和38％，肠化生组织bcl－2蛋白表达阳性率为53．3％，而p53和erbB－2均为阴性。高中分化腺癌MSI发生率（86．7％）显著高于低分化腺癌（38．7％）（P＜0．05），肠型胃癌MSI发生率（77．8％）显著高于胃型胃癌（40％）（P＜0．05）；MSI与胃癌患者年龄、性别、肿瘤的部位、大小、淋巴结转移、浆膜浸润、临床分期及bcl－2、erbB－2和突变型p53蛋白表达无显著相关。结论：MSI在胃癌的发生中可能起重要作用，可能是胃癌发生过程中的一个早期分子改变，其致癌机制不同于bcl－2、erbB－2及p53。     

放疗前后宫颈癌细胞凋亡及Fas,p53及bcl—2的表达

目的：探讨Fas ,p53及 bcl-2放疗前后的变化及与细胞凋亡的关系。方法：采用免疫组织化学SP法和脱氧核糖核酸转移介导的缺口末端标记（TUNEL）技术,分别检测40例宫颈鳞癌患者放疗前后同一位点凋亡阳性率及Fas,p53和bcl-2的表达。结果：放疗前后凋亡阳性率有显著性差异（P＜0．01）,放疗后Fas与p53表达明显升高（P＜0．01）,而bcl-2表达明显降低（P＜0．01）;放疗后p53与Fas及bcl-2表达有相关性（P＜0．05）,结论：Fas,P53及bcl-2对放射线诱导的宫颈癌细胞凋亡均具有重要调控作用。P53可能通过上调Fas在宫颈癌中的表达参与了放疗诱导的细胞凋亡过程。     

雷公藤甲素对乳腺癌细胞P53、P73基因甲基化的影响以及对细胞增殖的抑制作用

摘要 目的：研究雷公藤甲素（triptolide,TP）对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖的影响及其与P53、P73基因表达和甲基化状态的关系。方法：用不同浓度（10、20、40ng/ml）TP处理MCF-7细胞,采用MTT法检测TP对MCF-7细胞增殖的作用;RT-PCR检测MCF-7细胞甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达;甲基特异性PCR检测TP对MCF-7细胞P53/P73基因甲基化的影响; 蛋白质印迹分析检测MCF-7细胞中P53/P73蛋白的表达。结果：TP剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05, P<0.01）,其半数抑制浓度（IC50）约为20ng/ml（P<0.01）,高浓度（40ng/ml）时抑制率达（70.13.52）%。TP可明显抑制MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA（P<0.05,P<0.01）的表达。TP处理MCF-7细胞后P53启动子区的甲基化降低,TP(20ng/ml)处理后P53 mRNA的表达升高,而在高浓度(40ng/ml) TP作用下表达明显上调(P<0.0501);TP处理MCF-7细胞后P73基因启动子区的甲基化则明显降低,并呈剂量依赖性,且TP(20ng10ng/ml)处理后P73 mRNA的表达亦明显增强(P<0.0105) ,并呈剂量依赖性。蛋白质印迹分析检测TP(20ng/ml)处理MCF-7细胞后,P53、P73蛋白的表达均增强。结论：TP可通过抑制甲基转移酶活性、抑制P53特别是P73基因启动子区甲基化,促进P53/P73的表达,从而抑制MCF-7细胞的增殖。     

Thr187磷酸化p27kip1与人乳腺癌MCF-7细胞化疗敏感性的关系

目的探讨人乳腺癌MCF-7细胞中第187位苏氨酸（Thr187）磷酸化的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27kip1（P-p27Thr187）与化疗药物敏感性的关系。方法人乳腺癌MCF-7细胞常规培养,采用MTT法测定其对5种常用化疗药物[表柔比星（EPI）、多西他赛（DOC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、环磷酰胺（CTX）、顺铂（CDDP）]的敏感性;采用Westernblot检测经化疗药物作用后P-p27Thr187、p27kip1表达水平;采用免疫共沉淀方法检测P-p27Thr187与S期激酶相关蛋白2（Skp2）相互结合情况。结果5种常用化疗药物对人乳腺癌MCF-7细胞均有抑制作用,5-Fu的抑制率随浓度增加而增高,而其他4种化疗药物的抑制率开始随浓度增加而增高,但达到理论最高药物浓度（PPC）后降低（均P＜0.01）;在PPC下作用48h,抑制率从大到小的化疗药物依次为EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP。Westernblot结果显示化疗药物作用48h后,P-p27Thr187表达水平明显增加,以EPI、DOC增加最为明显（均P＜0.01）;p27kip1表达水平明显降低（均P＜0.01）。免疫共沉淀结果显示,经EPI0.25滋g/ml、DOC6.80滋g/ml作用48h后,P-p27Thr187与Skp2结合明显增加。结论P-p27Thr187与人乳腺癌MCF-7细胞化疗敏感性有关,可作为预测化疗敏感性及选择药物的一项新指标。     

术前植入5-Fu缓释剂对大肠癌的治疗

目的探讨大肠癌术前直肠黏膜植入5-Fu缓释剂（5-FuSR）后，药代动力学、毒副作用、肿瘤细胞凋亡和增殖及其调控基因的变化。方法将25例大肠癌随机分为两组：试验组（Ⅰ组）和对照组（Ⅱ组），两组均在手术前后取癌组织及癌旁组织，观察癌组织病理形态和识别凋亡癌细胞，SP免疫组化法检查给药前、手术后肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、凋亡、p53及Bcl-2基因表达状况。结果Ⅰ组用药后24、48、72h外周5-Fu血药浓度维持较稳定，差异无显著性（P〉0．05）；72h时门静脉血浓度显著大于外周血（P=0．013）；癌组织浓度显著高于癌旁组织。Ⅰ组术后凋亡指数显著高于术前（P〈0．001）；术后癌细胞的增殖指数较术前明显降低（P〈0．01）；凋亡抑制基因Bcl-2表达术后较术前显著下调（P=0．03）；p53基因突变与非突变者，二者术后Bcl-2表达均较术前下调。结论直肠黏膜下植入抗肿瘤药是术前区域性化疗的最佳途径；5-FuSR药代动力学和药效学满意，大肠癌细胞凋亡增加，凋亡抑制基因Bcl-2表达明显下调，并且对p53基因突变者亦有较好疗效。     

GP73通过p53信号通路调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖和凋亡

目的 探讨高尔基蛋白73(GP73)对乳腺癌细胞MCF-7的增殖、凋亡的影响及相关机制.方法 利用干扰及过表达GP73质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,并利用CCK-8检测处理后细胞的增殖能力,利用流式细胞术方法检测处理组细胞的凋亡水平,利用qRT-PCR和Western印迹法测定GP73和p53 mRNA和蛋白的表达.采用qRT-PCR测定20例临床乳腺癌和癌旁组织中GP73和p53的mRNA水平,并分析乳腺癌组织中GP73和p53的mRNA水平的相关性.结果 过表达GP73后MCF-7较对照组增殖能力上升(P＜0.05),凋亡水平下降(P＜0.05);干扰GP73后MCF-7增殖能力下降(P＜0.05),凋亡率升高.同时过表达GP73和p53的乳腺癌细胞较单独过表达GP73的MCF-7细胞的增殖能力下降,凋亡水平上升.乳腺癌组织中GP73和p53 mRNA表达也呈负相关(r=-0.528,P＜0.01).结论 GP73可能通过p53信号通路调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖和凋亡.     

pCMV6-Entryp62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立

【目的】构建pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系。【方法】以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证;将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量PCR和Western blotting进行验证。【结果】酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62mRNA的表达显著升高;Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带。在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高。【结论】成功构建了pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系。     

胃癌癌前病变中医证候与凋亡相关癌基因mRNA表达的关系

【目的】 探讨胃癌癌前病变(PLGC)中医证候与bcl-2癌基因和p53抑癌基因mRNA表达的关系。【方法】经胃镜及病理证实为PLGC病例共40例,其中中度异型增生24例,重度异型增生9例,不完全性结肠化生7例;兼气滞证10例,兼胃热证12例,兼血瘀证18例。采用原位分子杂交的方法检测胃粘膜活检标本bcl-2癌基因和p53抑癌基因mRNA表达。【结果】本组PLGC中,bcl-2癌基因和p53抑癌基因在转录水平均有过度表达,并随病变的进展而表达逐渐增高。在不同的兼证中,bcl-2癌基因和p53抑癌基因mRNA的表达强度依次为兼气滞证<兼胃热证<兼血瘀证。【结论】bcl-2癌基因和p53抑癌基因在PLGC中有异常表达,其表达与不同兼证有关且可能有一定的证候特异性。     

瘦素对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

目的: 研究瘦素对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法: 选取处于对数生长期的MCF-7细胞,随机分为对照组和20、40、80 μg·L^-1瘦素处理组。CCK8试剂盒检测各组MCF-7细胞增殖率;流式细胞术检测各组MCF-7细胞凋亡率;RT-PCR和Western blotting法分别检测各组MCF-7细胞bcl-2和bax的mRNA和蛋白表达水平;在抗凋亡作用的信号通路筛选实验中采用Western blotting法检测不同信号通路抑制剂处理组MCF-7细胞p-AKT和bcl-2的蛋白表达水平。结果: 与对照组比较,不同剂量瘦素处理组MCF-7细胞增殖率升高(P<0.05),且呈剂量依赖性,不同剂量瘦素组之间比较差异也有统计学意义(P<0.05);随着瘦素作用剂量增加,不同剂量瘦素处理组细胞凋亡率逐渐降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,不同剂量瘦素处理组MCF-7细胞 bcl-2 mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05),bax mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);与瘦素组比较,PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002处理组MCF-7细胞的p-AKT和bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论: 瘦素对乳腺癌MCF-7细胞有促进增殖和拮抗凋亡的作用,其抗凋亡效应与通过细胞信号通路PI3K-AKT促进bcl-2表达有关。     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的研究

目的构建靶向多药耐药基因（MDR-1）的短发夹RNA（short hairpin loop RNA shRNA）干扰表达质粒，并探讨其逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的作用效果。方法根据MDR-1基因表达序列设计有效的RNA干扰片断，构建并获得MDR-1基因特异的shRNA质粒表达载体pRNAT-U6.1/Neo－mdr1，采用lipofectin2000分别转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR，利用G418筛选稳定表达的细胞克隆。利用RT-PCR检测MDR-1-RNA的表达，Western Blotting检测MDR-1蛋白质的表达，MTT法检测耐药逆转效果，罗丹明123外排实验检测p-gp的转运功能。结果成功构建表达siRNA的质粒载体pRNAT-U6.1/Neo－mdr1，转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR后48h及G418筛选后1、2月，mdr1-RNA及蛋白质表达均呈明显下降，p-gp的转运功能明显提高，对阿霉素的敏感性增强，与耐药细胞及转入空白载体的细胞比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。筛选后1、2月与转入48h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论shRNA干扰表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-mdr1能够稳定、持久的抑制MDR-1基因，逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性。