Smurf1拮抗BMP-2对C2C12细胞的诱导成骨作用

目的研究Smad泛素化调节因子1（Smurf1）对基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）诱导成骨作用的影响。方法通过将质粒pcDEF3-Smurf1临时转染C2C12细胞并应用实时PCR和Western免疫印迹法鉴定其表达Smurf1，空载体pcDNA3．1作为阴性对照；然后用比色法测定细胞碱性磷酸酶活性和实时PCR分析细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达，观察Smurf1对rhBMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的影响。同时在相差显微镜下观察细胞形态的变化。结果Smurf1在C2C12细胞可以通过临时转染获得很好的表达。尽管在细胞形态上没有明显的差别，但Smurf1转染的C2C12细胞在rhBMP-2作用48h后，细胞碱性磷酸酶活性以及细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达均较对照组明显下降。结论Smurf1在BMP诱导成骨过程中发挥着负性调节作用。     

Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证

目的:研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法:根据Myo-statin mRNA序列,选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链,退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体,构建3个RNAi阳性质粒:M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSilencer并转染C2C12细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot观察RNAi对C2C12细胞中MyostatinmRNA和蛋白表达的下调作用。结果:构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量逐渐降低。结论:成功构建Myostatin RNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。     

外源性分化抑制因子Id2在C2C12细胞中的表达

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C2C12细胞中的表达。方法：RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达载体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C2C12成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向I（12cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C2C12细胞,转染8h时,转染效率约为（10．5±2．8）％;转染12h后,转染效率约为（20．9±3．1）％;转染24h后,转染效率最高,约为（60．8±3．2）％。结论：成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C2C12细胞。     

LncRNA AK051397在BMP-2诱导的C2C12成骨分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）诱导后表达上调的LncRNA AK051397在C2C12成骨分化过程中的作用。方法 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程,实时定量PCR技术与碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨相关指标。对C2C12细胞在BMP-2诱导下,成骨分化过程中的LncRNAs表达变化进行芯片分析（ArrayStar LncRNA Array）,筛选出表达明显上调的LncRNAs,最后采用siRNA干扰的方法下调LncRNAs表达后分析其对成骨分化过程的影响。结果 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程中,成骨指标ALP、SPT增高,成肌指标MYOG降低。芯片结果表明,LncRNA AK051397在BMP2诱导后表达明显上调,处理组与未处理组相比升高4.9倍（P〈0.05）。干扰AK051397后成骨分化指标ALP、SP7表达下降,MYOG表达上升。结论 LncRNA AK051397在C2C12细胞中具有促进成骨分化的作用,同时也具有抑制细胞成肌分化的作用。     

A Provincial Hospital C.C.U. After ISIS 2

A prospective study of admissions to an Irish provincial coronary care unit in the light of reported benefits of streptokinase and oral aspirin as reported in the Isis study was carried out. of 115 patients admitted with suspected myocardial infarction (M.I.), the diagnosis was confirmed in 41. The average delay from onset of chest pain to admission to C.C.U. was 6.65 hours (0.3 – 18 hours, median 6 hours). Twenty-six of the 41 patients were given streptokinase after a median time lapse of six hours from the onset of pain. 88% of the M.I. patients were on oral aspirin at discharge but only 12% were on oral beta blockers. These findings are compared with the findings of the Isis 2 study worldwide and in Ireland. The presence of risk factors in the patients with M.I. is analysed, 16 of the 41 had serum cholesterol levels greater than 6 mmols/1. As an index of community risk factor screening, an enquiry was made of the patients and of their family doctor as to whether serum cholesterol had previously been checked, this had been done in only 12 of 41 and in only 2 had it been carried out by the family doctor. Pre-hospital analgesic use was also examined and 36 of the 41 patients had chest pain and were seen by their G.P.s but only 18 were given analgesics of whom 13 received morphine. We conclude that greater public education is necessary to reduce the delay in summoning help after an M.I., greater efforts are needed by hospitals to streamline admissions to the C.C.U. and to provide mobile C.C.U. in rural areas and greater efforts are required by family doctors to provide risk factor screening and to provide adequate analgesia in patients with M.I. prior to hospital admission.     

Nesprin-1在C2C12肌原细胞系分化过程中的作用

 目的 探讨Nesprin-1在肌细胞分化过程中的作用。方法 将C₂C₁₂肌原细胞分化成肌小管,采用Western blot和免疫荧光技术检测Nesprin-1蛋白表达水平和亚细胞定位在肌小管分化成熟过程中的改变;同时利用RNA干扰技术抑制Nesprin-1蛋白的表达,观察其对C₂C₁₂肌原细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在C₂C₁₂肌原细胞系分化过程中表达水平以及在细胞中的定位有明显改变。Nesprin-1 siRNA组与对照组相比,分化前后C₂C₁₂细胞中Nesprin-1蛋白表达明显降低,同时分化后肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白（myosin）的表达量以及肌小节的数量比对照组均明显减少（P<0.001）。结论 本文证实Nesprin-1了对骨胳肌细胞分化至关重要,不同分子大小Nesprin-1亚型在C₂C₁₂肌原细胞分化过程中发挥各自的特殊作用,在该细胞质与细胞核中的也有不同的作用。     

抵抗素对C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响

【目的】 抵抗素(resistin)是一种与胰岛素抵抗(IR)密切相关的脂肪细胞因子&#65377;本研究通过观察resistin对C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响,以探讨resistin在骨骼肌IR发生中的作用&#65377;【方法】构建含resistin基因的重组表达质粒pcDNA3.1-resistin,用于转染C2C12肌细胞株,使其表达resistin,用3H-2-脱氧葡萄糖进行葡萄糖摄取试验,用D-[14C(U)]葡萄糖进行葡萄糖氧化和糖原合成试验,RT-PCR检测肌细胞的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRMA&#65377; 【结果】 pcDNA3.1-resistin转染的C2C12肌细胞株可表达resistin;resistin使肌细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取率减少约30%,并使GLUT4mRNA 表达降低28%,而对葡萄糖氧化和糖原合成无显著影响&#65377; 【结论】 resistin可能通过抑制骨骼肌GLUT4mRNA的表达而降低葡萄糖摄取,但对葡萄糖氧化和糖原合成影响较小,提示resistin在骨骼肌IR发生中的作用有限&#65377;     

二十二碳六烯酸改善棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗作用

目的 观察二十二碳六烯酸(DHA)对棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗的影响.方法 将C2C12细胞诱导分化成熟,加棕榈酸及DHA处理,通过实时聚合酶链反应(real-Time qPCR)及免疫印迹检测C2C12细胞葡萄糖转运体4(GLUT4)、胰岛素受体-β(IR-β)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达;谷胱甘肽检测试剂盒检测超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,荧光分光光度计检测活性氧(ROS);[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖检测C2C12细胞葡萄糖摄取量.结果 棕榈酸组与对照组比较,磷酸化胰岛素受体底物-1(P-IRS-1)的表达上调[(2.9±0.3)比(1.1±0.1),P＜0.05];磷酸化胰岛素受体-β(p-IRβ)表达下调[(0.87 ±0.09)比(1.58±0.21),P＜0.05];GLUT4表达下调[(1.1±0.3)比(3.3±0.4),P＜0.05];炎症分子MCP-1、IL-6、iNOS表达明显上升:[MCP-1:(27.2±0.6)比(1.0±0.1),P＜0.001;IL-6:(94.9 ±6.5)比(0.8±0.0),P＜0.001;iNOS:(288.0±15.6)比(1.8±0.6),P＜0.001].C2C12细胞氧化应激标志物ROS升高2.1倍(P＜0.05),SOD、GSH-Px活性分别下降63％及49％(P＜0.05);DHA组与棕榈酸组比较,p-IRS-1的表达下调[(1.3±0.2)比(2.9±0.3),P＜0.05],p-IRβ表达上调[(1.3±0.2)比(0.9±0.1),P＜0.05],GLUT4表达明显升高[(2.8±0.4)比(1.1±0.3),P ＜0.05];炎症分子MCP-1、IL-6、iNOS表达均明显下调[MCP-1:(18.5±0.3)比(27.2 ±0.6),P＜0.001;IL-6:(1.7±0.4)比(94.9±6.5),P＜0.001;iNOS:(5.0±0.9)比(288.0 ±15.6),P＜0.001],氧化应激标志物ROS下降55％(P＜0.05),SOD、GSH-Px活性升高72％及64％ (P ＜0.05).结论 DHA通过激活C2C12细胞的胰岛素信号通路,减少细胞的炎症反应及氧化应激而改善胰岛素抵抗.     

C2C12细胞体外微型灌注生物反应器培养初探

目的 研究组织工程种子细胞C2C12在微型灌注生物反应器中培养的特点,以期探索一种有效的种子细胞体外培养方法.方法 在自行研制的微型灌注生物反应器中以20%换液量/天、30%换液量/天两种条件进行C2C12细胞培养,通过细胞形态、生长曲线、细胞群体倍增时间及生化代谢离线检测等对培养情况进行研究.结果 微型灌注生物反应器培养较传统的细胞培养瓶培养,培养基使用效率提高;在细胞形态无显著性变化的情况下,细胞群体倍增时间显著缩短.而且,C2C12细胞的生化代谢在20%换液量/天灌注条件下较30%换液量/天的为佳.结论 C2C12细胞的灌注生物反应器培养方式较传统的细胞培养瓶培养方式优越,同时,20%换液量/天的灌注条件较30%换液量/天为佳.该灌注培养体系值得进一步深入研究.     

CYP2C19和CYP2C9基因型与苯妥英血药浓度关系的研究

目的　探讨细胞色素氧化酶P4 5 0 2C19(CYP2C19)和CYP2C9基因型对癫痫患者苯妥英血药浓度的影响。方法　对 32例癫痫患者应用变性高效液相技术分析中国人常见的 2个CYP2C19和 1个CYP2C9等位基因变异 ,应用荧光偏振免疫法测定患者苯妥英的血药浓度 ,在进行标准化以排除剂量和体重对血药浓度的影响后 ,分析CYP2C19和CYP2C9基因型和苯妥英血药浓度的关系。结果　服用单一苯妥英药物的 32例患者中 ,CYP2C19 2、CYP2C19 3和CYP2C9 3等位基因频率分别为 31%、8%和 6 %。根据携带CYP2C19和CYP2C9突变等位基因的数量 ,将患者分为基因型为CYP2C19 1/ 1合并CYP2C9 1/ 1的野生型纯合子强代谢者 (EM) ,基因型为CYP2C19 1/ 2或CYP2C19 1/ 3的杂合中间代谢者 (IM) ,基因型为CYP2C19 2 / 2或CYP2C19 2 / 3或CYP2C19 1/ 2合并CYP2C9 1/ 3的突变型纯合子弱代谢者 (PM)。 3组频率分别为 34%、4 4 %、和 2 2 %。并且突变基因携带数量与标准化血药浓度呈正相关。PM患者服用同等剂量苯妥英时血药浓度比EM患者高 34% (P <0 0 1)。结论　苯妥英代谢受CYP2C9和CYP2C19基因调控。根据患者CYP2C19和CYP2C9基因型可以预测患者的药物浓度 ,有利于临床选择适宜的苯妥英初始剂量     

不同浓度的维生素C对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察不同浓度的维生素C（VitC）对体外培养的骨骼肌成肌细胞（C2C12）增殖、凋亡的影响。方法：取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,调整细胞密度,按200 μL/孔接种,常规培养,待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,将细胞分6组：阴性对照组（C2C12 细胞中加入单纯无血清培养基）、H2O2组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基）和VitC 1,2,3,4组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基的基础上,分别加入不同浓度的VitC：10,20,60,100 mg/L）。分别在干预0,6,24,36,48,72 h后采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测各组C2C12细胞的增殖。在干预36 h后采用Annexin V-PI双染法检测各组C2C12细胞凋亡率。结果：在干预36和72 h时,各浓度的VitC组的吸光度（OD）值均较H2O2组显著升高（P＜0.001）,其中以VitC 4组升高最为显著,而且VitC 4组在干预36 h时的吸光度值高于阴性对照组（P＜0.05）;在干预36 h时,VitC 2,3和4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于H2O2组;VitC 2和3组的C2C12成肌细胞凋亡率高于阴性对照组,而VitC 4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于阴性对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：VitC能够有效抑制H2O2诱导的C2C12成肌细胞的凋亡,高浓度的VitC可能在干预36 h时对C2C12成肌细胞有促增殖的作用。     

单抗Mab03.2C1C2影响白念珠菌芽管形成及粘附作用的实验研究

目的观察抗白念珠菌芽管单抗Mab03.2C1C2在体外对白念珠菌感染的保护性作用.方法将不同浓度的Mab03.2C1C2分别与白念珠菌孢子悬液、白念珠菌孢子和人口腔粘膜上皮细胞混合液、白念珠菌孢子和胎儿脐静脉内皮细胞混合液共同孵育,观察Mab03.2C1C2对白念珠菌芽管生成的抑制作用及其对白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞粘附的抑制作用.结果Mab03.2C1C2能显著降低白念珠菌芽管生成率及在芽管形成条件下对上皮细胞、内皮细胞的粘附,其抑制作用与该单抗的浓度成正比.结论Mab03.2C1C2在体外能抑制白念珠菌芽管的形成,通过抑制白念珠菌芽管的形成而抑制白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞的粘附,降低白念珠菌的侵袭力.     

乙醛脱氢酶2减轻多柔吡星所致细胞毒性作用的机制

目的：探讨乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)对多柔吡星(doxorubicin,DOX)所致肌原细胞毒性的保护作用及其机制。方法：以小鼠C2C12肌原细胞为研究对象,通过基因转染方式调节细胞内ALDH2表达水平,以流式细胞术检测细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖抑制率,化学荧光法检测组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)、4羟壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)蛋白加合物含量及caspase-3/7活性,Western印迹检测Bcl-2,NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)、胞浆调节亚单位p-p47PHOX水平。结果：ALDH2过表达可显著降低DOX所致C2C12细胞凋亡及增殖抑制,而抑制ALDH2的表达则增加DOX对C2C12细胞凋亡诱导及增殖抑制作用;ALDH2过表达可下调p47PHOX磷酸化水平,抑制NOX2活化及ROS生成,而ALDH2低表达则上调p47PHOX磷酸化水平,促进NOX2活化及ROS生成;此外,NOX2活性抑制剂apocynin可抑制p47PHOX磷酸化、ROS生成及caspase-3/7的酶活性,同时增加 ALDH2酶活性及其mRNA水平。结论：DOX所致的肌原细胞毒性与NOX2依赖性细胞氧化应激增强、ALDH2酶活性及表达降低有关,而ALDH2通过抑制上述NOX2信号,减轻细胞凋亡而发挥保护细胞作用。     

温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9基因多态性分析

目的：研究温州地区汉族人群CYP2C19、CYP2C9基因多态性分布。方法：采用聚合酶链式反应和测序方法,对287例健康人群CYP2C19、CYP2C9基因多态性进行分析。结果：温州地区汉族人群的CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3三种等位基因的频率分别为65.16%、29.27%和5.57%;CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3基因型的频率分别为44.95%、33.45%、6.97%、4.18%、10.45%和0.00%,弱代谢率为14.63%;CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因频率分别为97.74%和2.26%,CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3的基因频率为95.47%和4.53%,未发现CYP2C9*3/*3。结论：温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9弱代谢率与已报道的汉族人群基本一致,与日本人群相近,显著高于欧美人群。     

低氧促进C2C12细胞增殖及相关机制探讨

目的：探讨低氧对小鼠骨骼肌成肌细胞系C2Cl2细胞增殖的影响及其增殖的可能相关机制。方法：采用血细胞计数板法和流式细胞仪观察低氧（10％O2）对C2Cl2细胞数量和增殖指数的影响；用RT—PCR和Western blot方法检测低氧诱导因子-1α（HIF—1α）mRNA和蛋白水平的表达。结果：低氧组细胞较常氧组细胞数量和增殖指数增加（P〈0．01）；HIF—1αmRNA和蛋白水平变化在常氧组和低氧组细胞中无显著差异。结论：低氧可促进C2Cl2细胞的增殖，其增殖机制可能不是直接通过HIF—1αmRNA和（或）蛋白水平量的多少来调控。     

周期性牵张应力对C2C12成肌细胞凋亡的影响

目的探讨不同条件下的周期性牵张应力对C2C12成肌细胞凋亡的影响。方法利用细胞加力仪器与弹性加力板对体外培养C2C12成肌细胞施加不同频率、不同幅度的牵张应力。细胞计数、MTT实验观察细胞的活性,并利用Western Blot,DNA ladder,PARP剪切实验等方法检测在应力条件下成肌细胞凋亡规律。结果较低幅度的牵张应力(5%和10%),促进成肌细胞的增殖;随着牵张应力的幅度的增大,当拉伸条件为15%及20%时,细胞数目较对照组显著降低(P<0.05),DNA ladder实验和PAR P剪切实验发现随着拉伸幅度的增加,剪切型的PARP逐渐增多,DNA ladder显示凋亡特征的带型逐渐出现,并且随着幅度的增加,凋亡带逐渐明显。结论在较低幅度的牵张应力作用下,成肌细胞以增殖为主,随着应力的增大,细胞开始凋亡。临床医生牵张成骨治疗过程中,应注意合理施力。     

C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

 摘 要： 【目的】 观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞C 2C 12向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用，探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】 将C 2C 12成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖DMEM培养基培养，收集细胞，在相差显微镜下观察形态变化，并通过免疫细胞化学（Imminocytochemistry，ICC）及RT-PCR方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】 ①20 mL/L和50 mL/L的马血清均能促使C 2C 12细胞形成肌小管，20 mL/L浓度马血清诱导效率最好（第7天时肌小管形成率分别为31．4％ ± 2．1％和19．0％ ± 1．6％，P<0．001）。②20 mL/L马血清诱导3～4 d开始有肌管形成，之后肌管越来越多，到8～9 d达高峰（第9天40．2％ ± 1．3％），往后细胞逐渐衰老死亡。③20 mL/L马血清诱导C 2C 12细胞向成熟肌细胞分化过程中，肌相关蛋白分子表达发生变化：结蛋白（desmin）、成肌分化抗原（MyoD）、生肌素（myogenin）和肌球蛋白（myosin）等表达逐渐增强（未刺激时分别约为49．6％ ± 1．1％、23．4％ ± 1．1％、4．8％ ± 1．6％和2．6％ ± 1．5％；第6天时分别提高为80．4％ ± 1．8％、85．4％ ± 1．1％、22．2％ ± 1．1％和26．0％ ± 1．6％；P<0．001）；desmin、MyoD和myogenin相应的mRNA分子也可以通过RT-PCR检测到。【结论】 ①低浓度的马血清能够有效刺激C 2C 12成肌细胞向成熟细胞分化，以20 mL/L浓度效果最好；②C 2C 12细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板；③肌分化发育过程比较复杂，许多因素都可能起影响，研究设计要尽量标准化。     

寰枢椎椎弓根螺钉系统在上颈椎不稳的应用

目的探讨寰枢椎椎弓根螺钉固定系统用于上颈椎不稳的效果。方法 2005年2月~2009年5月,23例上颈椎不稳患者,年龄17~64岁,平均43.6岁,男15例,女8例。新鲜骨折12例,陈旧性骨折7例,寰椎横韧带断裂4例;齿状突骨折按Anderson-D’Alonzo分型,Ⅱ型11例,Ⅲ型8例;7例合并神经系统症状。所有患者术前给予颅骨牵引,根据术前三维CT成像的指导确定寰枢椎进针角度以及长度。一般为椎弓根螺钉3.5mm,寰椎14~16mm,枢椎24~28mm。对术前三维CT提示寰椎有异常的病例在开口点打开皮质后给予刮齿行进钉通道松质骨刮出,直接显露出约8~10mm通道,避开椎管后顺势植入螺钉。结果所有患者手术顺利,手术时间110~170min,术中出血量210~600ml,平均350ml。术前7例合并神经系统症状者术后均完全恢复。1例术后摄片提示为寰椎椎弓根钉偏离,耳周疼痛,6月后三维CT复查,植骨融合,拔除内固定。术后复查全部患者植骨融合,内固定无松动,头部活动受限均不明显。结论寰枢椎椎弓根内固定系统治疗齿状突骨折具有固定阶段短,三维固定,融合率高,对头颈部活动影响小等优点。