小鼠胚胎整体原位杂交实用技术的建立

目的 优化小鼠胚胎整体原位杂交及数据分析方法。方法 小鼠胚胎用4％多聚甲醛4％固定过夜，10mg／L蛋白酶K(PK)室温消化30min，预杂交2h后，加入探针63℃反应16～18h，用盐溶液高温洗涤多次，RNA酶37℃消化1h，封闭4h后加入地高辛抗体4℃过夜。抗体反应后反复洗涤并在水平摇床上振摇，NBT和BCIP显色系统避光显色。提取图像灰度值，扣除背景、对照等假阳性信号。结果 KIAA1708探针在脑、脊髓等8个区域有杂交信号，对图像数据分析结果表明，只有1个区域的信号在95％可信限范围内，为阳性信号。结论 通过控制蛋白酶K消化时间、探针和地高辛抗体浓度，以及洗涤、显色过程，得到了低本底、着色清晰的杂交结果，结合图像的数据分析步骤，消除假阳性结果。建立了一套实用的小鼠胚胎整体原位杂交方法。     

Runx3敲减抑制BMP9诱导小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs向成骨分化

目的研究Runx3敲减对BMP9诱导的小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs成骨分化的作用。方法 BMP9腺病毒感染iMEFs,用Western blot检测内源性Runx3蛋白的表达。Runx3干扰腺病毒ad-siRunx3和BMP9条件培养基共同处理iMEFs,用碱性磷酸(ALP)染色和活性定量测定检测成骨早期指标ALP;用茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积;用RT-PCR检测成骨相关基因Id1、Id2、Id3和Runx2,用Western blot检测成骨相关蛋白Dlx5;用SBE荧光素酶报告质粒检测smad1/5/8的转录活性。结果 BMP9可以使Runx3表达降低(P0.05);干扰Runx3可以抑制早期成骨指标ALP活性(P0.05)和晚期成骨指标钙盐沉积;ad-siRunx3抑制BMP9诱导的成骨相关转录因子Id1、Id2、Id3和Runx2基因的表达(P0.05)及DLX5蛋白的表达(P0.05)。结论敲减Runx3可以抑制BMP9诱导小鼠胚胎成纤维细胞向成骨分化。     

小鼠Cpne5基因mRNA水平的表达分布及其在胚胎的表达定位

目的明确小鼠Cpne5基因在mRNA水平的组织表达分布及其在胚胎的表达定位。方法提取新生、成年小鼠主要脏器的总RNA,利用RT-PCR法检测Cpne5 mRNA的表达量;合成针对Cpne5 mRNA的杂交探针,取不同胎龄胎鼠进行整体原位杂交。结果 Cpne5 mRNA在成年小鼠10种脏器组织均有不同程度的表达,以大脑,小脑,睾丸和肺脏表达量较高;而肝脏和肌肉未表达。新生小鼠9种脏器中,Cpne5表达量最高的是脑组织,眼和肾次之,肺和肝脏表达量很少。制备并评估Cpne5原杂探针的产量,SP6转录的反义探针浓度为100ng/μL,T7转录的正义探针浓度为10ng/μL,原位杂交结果显示Cpne5 mRNA主要表达于胎鼠的端脑、间脑、中脑及菱脑原节。结论在新生和成年小鼠的脑组织中Cpne5基因mRNA高水平表达,并在胎鼠发育过程中定位于胎脑。     

E8.5-E12.5大鼠胚胎整体原位杂交技术

目的:通过优化实验条件,建立大鼠胚胎整体原位杂交方法。方法:E8.5-E10.5大鼠胚胎4%多聚甲醛固定6 h,不经蛋白酶K消化;E11.5-E12.5胚胎4%多聚甲醛固定过夜,蛋白酶K系列稀释实验确定消化浓度和时间。E8.5-E12.5胚胎预杂交2 h,地高辛标记的甘油二酯激酶ζ(DGKζ)寡核苷酸探针杂交24 h,山羊血清封闭2.5～3 h,地高辛抗体4℃过夜,冷TBST和NTMT漂洗1～2 h,NBT/BCIP避光显色。应用免疫组织化学方法观察DGKζ在E12.5大鼠胚胎组织的表达。结果:DGKζ在不同胚龄大鼠胚胎均有清晰的杂交信号,主要集中在神经系统;E12.5大鼠胚胎脑泡、背根神经节有较强表达,与免疫组化结果一致。结论:本研究建立了简便、可行、重复性高的E8.5-E12.5大鼠胚胎整体原位杂交方法。     

RNA原位杂交技术难点及针对措施

利用互补RNA为探针进行原位杂交是分析组织或细胞内RNA分布行之有效的方法,通过对RNA分布的研究可以了解特定基因的表达情况。用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的mRNA是较为常见的RNA原位杂交。该探针方法简便、探针较短,组织穿透性好,有较高的灵敏度。但是过程较长,操作繁琐,     

利用原位杂交技术研究SIPAR在小鼠不同发育阶段的表达

目的检测对STAT3信号通路有调节作用的新基因SIPAR（STAT3 interacting protein as a represor）在小鼠胚胎发育过程中不同阶段的表达.方法采用地高辛标记探针的整体胚胎原位杂交方法.结果 SIPAR在dpc9.5的小鼠胚胎眼泡和听泡中有明显的表达,在dpc9.5～12.5的小鼠胚胎脊柱神经和脑部中枢神经都有表达,在dpc12.5小鼠胚胎脑、眼泡和脊柱中表达增强.结论 SIPAR主要集中表达在小鼠胚胎的神经系统,SIPAR可能与神经系统发育相关.     

Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞并促进其成骨分化的研究

目的　利用重组Runx2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,使其Runx2基因的表达水平提高,观察BMSCs成骨相关基因的表达情况,研究Runx2基因促进BMSCs的成骨分化情况。 方法　PCR扩增Runx2基因,并连接到慢病毒表达载体质粒Pez-lv201,与包装质粒共转染293T细胞进行包装,测得慢病毒液滴度。取4周龄SD大鼠胫骨,分离、培养BMSCs,流式细胞仪鉴定。将Runx2重组慢病毒感染BMSCs。显微镜下观察细胞形态变化;RT-PCR分析BMSCs成骨基因的表达情况。 结果　Runx2基因重组慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定正确。测得慢病毒液滴度为1.6×109 TU/ml。流式细胞仪检测表面抗原CD90和CD105,表达率为99.8%、99.3%。重组慢病毒感染后实验组细胞形态呈成骨样细胞改变;对照组未见明显变化。实验组Runx2、OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN基因的表达水平随时间推移而增高;对照组上述基因均无明显表达。 结论　利用Runx2重组慢病毒感染BMSCs,使其高表达Runx2基因,可以使OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN基因表达增强,说明Runx2基因可以促进BMSCs向成骨方向分化。     

锯齿状病变组织中Runx3基因的甲基化及蛋白表达

目的探讨Runx3基因启动子区CpG岛甲基化状态和蛋白表达在锯齿状病变发生与癌变通路中的作用及意义。方法用TaqMan探针为基础的实时定量PCR(Methylight)法检测77例锯齿状病变(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)、16例正常结直肠组织和14例结直肠癌中Runx3基因CpG岛甲基化状态,同时用免疫组化法检测相应组织中Runx3蛋白的表达;并分析两者之间的关系。结果 Runx3启动子CpG岛甲基化率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分别为12.5%(2/16)和17.2%(5/29)、51.7%(15/29)、63.2%(12/19)和78.6%(11/14)。Runx3蛋白阳性表达率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分别为81.3%(13/16)和72.2%(21/29)、48.3%(14/29)、31.6%(6/19)、21.4%(3/14)。SSA/P、TSA和CRC 3组中Runx3甲基化与Runx3蛋白表达结果具有相关性(P0.05),且为负相关。结论 Runx3基因启动子区域甲基化是诱导Runx3蛋白表达下调或缺失的主要原因,在锯齿状病变尤其是锯齿状腺瘤的发生及癌变通路中起重要作用。     

D-半乳糖导致小鼠海马基因表达谱变化

本实验采用cDNA芯片研究D-半乳糖皮下注射小鼠海马的基因表达变化。小鼠皮下注射D-半乳糖[50m∥(kg．d)]60d造模，Morris水迷宫测试小鼠行为，分别提取模型组和对照组海马组织总RNA，掺入荧光分子Cy3和Cy5，经逆转录合成cDNA荧光探针与4000点小鼠cDNA基因芯片杂交。结果显示，在4000条待研究的基因中，两组小鼠海马间存在2倍表达差异的有76条，其中上调26条，下调50条。经分析，模型组基因表达谱与老年性痴呆(AD)相关基因表达谱在氧应激、能量代谢相关基因等方面有相似之处。提示D-半乳糖小鼠模型有可能作为拟AD病理模型。     

不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响

背景：低氧培养人胚胎干细胞的相关研究主要集中在干细胞多能性的维持及分化方面,而低氧对人胚胎干细胞基因表达水平的影响研究甚少。 目的：观察不同氧体积分数对人胚胎干细胞基因表达谱的影响。 方法：分别在低氧(体积分数5%O2)和常氧(体积分数21%O2)的条件下持续培养FY-hES-7细胞,收集晚期(第52代)细胞,运用全基因组表达谱芯片技术检测不同氧体积分数组FY-hES-7细胞的基因表达谱,并进行差异基因的功能富集分析及通路分析。 结果与结论：与常氧组相比,低氧组表达上调(>2倍)的基因1 840个,表达下调(>2倍)的基因1 676个。利用基因本体分析发现低氧组表达上调基因与细胞表面受体信号转导、免疫反应、离子转运、生物代谢及细胞活动等功能相关,而表达下调基因则与转录调控,依赖DNA的转录调控、神经分化、细胞形态、胚胎形态、胚胎器官及各系统发育等功能相关。通路分析发现低氧组表达上调的基因与细胞因子受体的相互作用、免疫反应以及造血系统等通路的改变相关,而表达下调的基因则多与胚胎发育及肿瘤通路改变相关。不同氧体积分数下长期培养的人胚胎干细胞基因表达谱存在明显的差异,低氧组出现差异表达基因的功能分析表明低氧有助于人胚胎干细胞的自我更新,防止分化及降低成瘤性。     

一个在小鼠头部特异表达的新基因BSG1 cDNA的克隆及研究

目的 克隆小鼠头部发育过程中特异表达的新基因并对新基因可能的功能进行初步分析。方法 采用消减差异筛选的方法筛选小鼠头部特异表达的新基因，并用生物信息学的方法对克隆到的新基因进行序列分析和蛋白结构域的预测。同时，还采用了小鼠胚胎原位杂交、小鼠脑部切片的原位杂交以及鸡胚的原位杂交方法研究BS61基因的表达情况。结果 克隆到1个与小鼠头部发育相关的新基因BSG1(brain specific gene 1)，其Gen Bank的登录号为AY210402。该基因包含1个2133bp的完整阅读编码框，编码1个710aa的C2H2型锌指蛋白。它与人的KIAA0441基因在氨基酸水平上有82.8％的同源性。该基因定位在小鼠的第10号染色体上，含7个外显子，6个内含子。BSG1主要在小鼠胚胎、鸡胚的头部表达，并且BSG1在小鼠头部表达的部位局限在海马、齿状回和小脑。结论 BSG1是1个可能的转录因子，在脑部特异表达。对其研究有助于进一步揭示大脑发育的分子机理。     

Trmt112 gene expression in mouse embryonic development

Mouse Trmt112, the homologous gene of yeast Trm112 (tRNA methyltransferase 11-2), was initially cloned from RIKEN with uncertain function. The yeast TRM112 is now known to play important roles in RNA methylation. Here, we studied the expression of Trmt112 by in situ hybridization and quantitative real-time RT-PCR (QRT-PCR). A higher expression level of Trmt112 was observed in the brain and nervous system by whole mount in situ hybridization from embryonic day 10.5 (E10.5) to E11.5. At later developmental stages E13.5 and E16.5, abundant expression was prominently found in various organs and tissues including developing brain, nervous system, thymus, lung, liver, intestine, kidney, and cartilage. Furthermore, Trmt112 was persistently expressed from E9.5 to E18.5 on whole embryos and highly expressed in multiple organs at E12.5, E15.5 and E18.5 by QRT-PCR. These results showed that Trmt112 gene was highly and ubiquitously expressed during mouse embryonic development, implying that it might be involved in the morphogenesis of diverse organs and tissues and numerous physiological functions.     

用RNA-RNA原位杂交技术研究Robo2在早期鸡胚发育中的表达

目的:探讨Robo2(roundabout homolog 2)在早期鸡胚发育中的表达。方法:利用分子生物学手段,构建Robo2/pSPT18重组质粒,并且制备地高辛标记的Robo2 RNA探针,进而通过RNA-RNA原位杂交技术检测Robo2在早期鸡胚发育中的表达。结果:原条发生前Robo2表达较弱,原条发生后主要表达在原条和神经板。体节期Robo2主要表达在脊索、神经管、体节和血岛部位。冰冻切片后观察到Robo2主要表达在外胚层,而在中胚层和内胚层只有部分表达。结论:阐明了Robo2在早期鸡胚发育中的表达,为进一步研究Robo2在正常生理和病理条件下的功能及作用机制奠定基础。     

精蛋白基因转录的组织和阶段发育特异性初步研究

采用精蛋白１、２基因探针与３例成人睾丸、肝、脾、肌肉提取的ＲＮＡ进行ＲＮＡ杂交，结果仅睾丸提取ＲＮＡ显示杂交阳性。又用人类精蛋白１基因探与人、大小鼠睾丸组织切片固定ＲＮＡ进行原位杂交，结果仅睾丸组织的曲细精管腔面的圆型精子细胞杂交阳性。     

The embryonic expression pattern of 40 murine cDNAs homologous to Drosophila mutant genes (Dres): a comparative and topographic approach to predict gene function

Nature often utilizes the same metabolic 'core groups' of interacting genes or 'pathways' in completely different organs, tissues and cellular compartments. Deciphering the physiological role of a particular gene in a living organism is therefore critical to understanding not only how a gene/protein works, but also where (in which tissue/organ) and when (at what developmental stage) it functions. We have performed systematic RNA in situ hybridization on a subset of murine genes homologous to Drosophila mutant genes, called Drosophila -related expressed sequences (Dres). This approach combines functional information derived from cross-species sequence comparisons and biochemical, physiological and pathological studies performed in the fly with knowledge of the spatial and temporal distribution of gene expression. Forty murine Dres were tested by RNA in situ hybridization on sagittal, coronal and transverse sections at three developmental stages, E10.5, E12.5 and E17.5. For some of them, whole mount in situ hybridization was performed at earlier stages. These data are valuable for establishing how the function of these genes and the genetic programs underlying the development of a particular tissue or organ have evolved during evolution. For example, six Dres genes showed restricted expression domains within the murine retina, suggesting a different role for each of these genes in eye development and functioning. Furthermore, the information derived from this combined approach will be instrumental in predicting the phenotypic consequences of gene dysfunction in both mouse mutants and human genetic diseases.