实时荧光定量PCR鉴别检测单纯疱疹病毒方法的建立

目的:建立快捷、灵敏、特异的单纯疱疹病毒(HSV)的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测及分型方法。方法:选择HSV1和HSV2的糖蛋白B基因设计一对通用引物和对应的探针组建2个FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品制作标准曲线,进行重复性和敏感性试验,以其他种类的细菌、病毒、真菌进行特异性分析,并用于检测生殖器疱疹患者的HSV1和HSV2。结果:HSV1和HSV2两标准曲线的线性检测范围均为105到1011Copies/L,相关系数均大于0.99,其他种类的细菌、病毒、真菌均未出现特异性扩增;48例生殖器疱疹患者疱液中HSV1和HSV2的检出率分别为6.3%(3/48)和87.5%(42/48)。结论:实时FQ-PCR法鉴别检测HSV1和HSV2,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,有助于HSV感染的流行病学和病理机制的研究;生殖器疱疹患者以HSV2感染为主。     

FQ-PCR法对孕前及孕中进行HCMV检测的临床意义

目的 运用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对孕前及孕中进行人巨细胞病毒(HCMV)检测,探讨受检者孕前及孕时感染HCMV的临床意义.方法 对302例孕前妇女和620例产前孕妇均做HCMV检测,取宫颈分泌物标本用FQ-PCR法做HCMV-DNA检测,取血清标本用ELISA法做HCMV-IgM检测.结果 302例孕前妇女宫颈分泌物标本HCMV-DNA阳性96例,血清标本HCMV-DNA阳性5例;620例产前孕妇宫颈分泌物标本HCMV-DNA阳性94例,血清标本HCMV-DNA阳性7例.可见用FQ-PCR法检测HCMV-DNA的阳性率远高于用ELISA法检测HCMV-IgM,ELISA法检测HCMV感染阳性率明显偏低,说明FQ-PCR法敏感性显著高于ELISA法.结论 宫颈分泌物组和血清组有明显差异,运用FQ-PCR技术对孕前及孕时进行HCMV检测具有重要的临床意义.     

巨细胞病毒感染的实验室调查和研究

目的:针对我院近一年来巨细胞病毒感染的实验室诊断进行调查和研究。方法:统计我科2012年7月至2013年8月期间酶联免疫吸附(ELISA)法测定的巨细胞病毒IgM(HCMV-IgM)抗体阳性患者,以及对阳性患者进一步用实时荧光PCR(FQ-PCR)法检测巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)结果。结果:在此期间共检测HCMV-IgM4601例患者,其中HCMV-IgM阳性为108例,阳性率为2.35%(108/4601);108例HCMV-IgM阳性患者进一步进行FQ-PCR法检测患者血清和尿液HCMV-DNA,阳性为50例,阳性符合率为46.3%(50/108)。结论:HCMV感染患者实验室诊断不能仅依赖ELISA法检测抗体,必须进一步采用FQ-PCR方法检测DNA加以提高疾病诊断率效率,严防误诊误治的发生。     

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的 比较常规PCR法与荧光定量RCR（RQ-PCR）法在人巨细胞病毒（HCMV）检测中的作用,寻找更适合于HCMV检测的方法。方法 构建携带CMV-DNA的标准质粒,利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果 FQ-PCR法对HCMV,标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规RCR法。结论 RCP法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。     

建立FQ-PCR定量体系检测新型隐球菌CAP10 mRNA

目的建立荧光定量PCR（FQ-PCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT—Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准血线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT—Easy—CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3．11X＋38．84。批内重复性试验CV值为0．31％,批间重复性试验CV值为2．73％。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为10^1copies／μL～10^8copies／μL。结论成功建立CN的CAP10mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。     

建立FQ-POR定量体系检测新型隐球菌CAP10mRNA

目的建立荧光定量PCR（FQ-PCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT—Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准血线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT—Easy—CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3．11X＋38．84。批内重复性试验CV值为0．31％,批间重复性试验CV值为2．73％。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为10^1copies／μL～10^8copies／μL。结论成功建立CN的CAP10mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

荧光定量PCR技术在诊断婴儿人巨细胞病毒感染中的应用

目的探讨荧光定量PCR技术（FQ-PCR）检测人巨细胞病毒（HCMV）-DNA在诊断婴儿HCMV感染中的临床价值。方法选取322例疑诊HCMV感染的婴儿,收集血液、新鲜尿液及母亲母乳,应用FQ-PCR检测HCMV-DNA。结果 322例疑诊HCMV感染的婴儿血液标本、尿液标本以及母乳标本的阳性率分别为15.2%,44.37%,57.15%。对母乳喂养的87例疑诊感染患儿进行尿液及对应母乳的FQ-PCR联合检测,其中40例尿液阳性的患儿母乳标本33例阳性,阳性率为82.5%;47例尿液阴性的患儿母乳标本24例阳性,阳性率为51.06%。结论 HCMV感染母乳是婴儿获得感染的主要途径之一。FQ-PCR是早期诊断婴幼儿HCMV感染的有效方法,对临床诊断及治疗有着重要的指导意义。     

实时荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌感染的效果

①目的 应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术准确定量检测临床标本中淋病奈瑟菌基因，同时与金标准—细菌培养法比较其灵敏度和特异度，为临床淋病的诊疗提供依据。②方法 采集l73例病人临床标本，以PE5700全自动PCR扩增分析仪和淋病奈瑟菌实时荧光定量PCR检测试剂盒进行核酸检测。同时，用含PolyViteX的巧克力板对淋病奈瑟菌进行分离，用ATB Expression自动细菌鉴定仪及配套的APINH进行鉴定。③结果 173份临床标本中，荧光定量PCR法示47例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为27．2％；细菌培养法示41例淋病奈瑟菌阳性，阳性率为23．7％。与细菌培养法相比，荧光定量PCR法的灵敏度为100％，特异度为95．5％，两者的符合率为96．5％。④结论 荧光定量PCR技术具有简便、快捷、灵敏度高、特异度高、定量准确等优点，在临床检测淋病奈瑟菌中具有良好的应用前景。     

Rapid detection of human cytomegalovirus DNA in urine samples by polymerase chain reaction in vitro gene amplification

In the detection of human cytomegalovirus (HCMV) DNA in the urine by polymerase chain reaction (PCR). We have designed and synthesized two pairs of oligonucleotide primers (patent pending) corresponding to the specific and conserved DNA sequences of HCMV AD 169 strain. The sequences of the primers were checked that they did not have cross reaction with either normal human genomic DNA or with other herpesviruses. As less as 1fg of HCMV DNA (equal to the amount of DNA from four HCMV virions) in urine can be detected by the method A total of 47 urine specimens from infants suspected of HCMV infection was examined by PCR and conventional virus isolation simultaneously 31 samples were positive in both PCR and virus isolation; 12 samples were negative in either; 4 samples were positive in PCR but negative in virus isolation. So the samples were further examined by serology and the data showed that there was HCMV-specific IgM in all the virus isolation negative sera examined. The result suggests that HCMV in the above samples is possibly underdetected by virus isolation. Therefore the method described in the paper is a specific, sensitive, rapid conventional and non radioisotopic one for detection of HCMV in urine samples.     

NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较

目的：建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法,并对其检测结果进行比较。方法：设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果。结果：成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法;特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性;灵敏度检测,常规PCR检测限为10⁶ mL^-1 ,FQ-PCR检测限为10⁴ mL^-1;模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致。结论：常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍。     

涂片、培养和实时荧光定量PCR检测在妇科的临床应用

目的：比较涂片革兰染色、培养和实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测妇科性病淋球菌感染的临床应用价值,寻找一种快速而敏感的淋球菌检测方法。方法：同时用涂片革兰染色、培养和FQ-PCR检测临床疑诊淋病123例女性阴道标本中的淋球菌,以培养法为“金标准”,将另外两种方法与之比较,分别计算其敏感性、特异性、阳性预期值和阴性预期值。结果：涂片检出率为76．4％、培养法检出率为66．7％、FQ-PCR检出率为69．9％;经配对计数资料Х^2检验,FQ-PCR与培养法的检出率比较差异无显著性（P〉0．05）。涂片法和FQ-PCR法的敏感性、特异性、阳性预期值和阴性预期值分别为94．2％、66．7％、87．2％、82.8％和97．6％、89．7％、95．3％、94．6％。结论：FQ-PCR检测淋球菌,可弥补涂片法较粗糙、培养法耗时长的缺点。FQ-PCR具有准确快速,敏感性和特异性较高的特点,是一种具有临床应用价值的淋球菌快速定量检测方法。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立

目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法。方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8。分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价。以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估。结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在10⁶-106-10⁽¹¹⁾Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10(11)Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10⁵Copies/L,最低检测限为5×105Copies/L,最低检测限为5×10⁵Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均<5.5%;与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965。以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100%,灵敏度分别是93.1%、80%、100%。结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光PCR定量标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(FQPCR)的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原(PSA)mRNA的表达。方法以Trizol裂解抽提法提取LNCaP细胞的总RNA。以RTPCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增;以AT载体克隆法制备重组质粒,并转化E.coliDH5α菌提取重组质粒,联合用氨苄青霉素筛选法和α筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。