供体骨髓细胞输注诱导大鼠肢体移植免疫耐受

目的 探讨环磷酰胺(CP)加供体脾细胞输注联合供体骨髓细胞(DBMC)输注诱导大鼠肢体移植免疫耐受的效果及机制.方法选择25只雄性Wistar大鼠、25只雌性SD大鼠分别作为肢体移植的供体和受体.实验分为五组:A组:无处理对照组,B组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注预处理;C组:受体在肢体移植前给予CP预处理,D组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注加CP预处理,E组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注联合DBMC输注加CP预处理,每组5只.建立肢体移植动物模型,诱导耐受后观察大鼠一般情况,移植肢体排斥反应出现时间及存活时间,通过混合淋巴细胞培养确定耐受状态,采用PCR检测嵌合体的形成.结果 E组肢体移植物的存活时间[(27.6±1.1)d]较A组[(6.8±0.4)d]、B组[(7.2±0.8)d]、C组[(7.8±1.3)d]、D组[(17.8±0.8)d]显著延长,差异均有统计学意义(P＜0.01).混合淋巴细胞反应E组特异性抑制率[(88.00±1.06)%]显著高于B组[(36.90±1.08)%]、C组[(37.90±0.95)%]和D组[(67.20±1.12)%],差异均有统计学意义(P＜0.01).E组嵌合体呈阳性.结论联合CP加供体脾细胞输注及DBMC输注可一定程度诱导大鼠同种异体肢体移植的免疫耐受,延长移植物存活时间.嵌合体的形成可能与免疫耐受的形成及维持有关.     

嵌合体在同种心脏移植免疫耐受中的作用

目的探讨嵌合体在同种心脏移植免疫耐受中的作用.方法采用大鼠腹部心脏移植模型,将30只Lewis大鼠随机分成正常对照组(Ⅰ组)、排斥反应组(Ⅱ组)、免疫耐受组(Ⅲ组),每组10只.观察移植心存活时间,供心病理学改变,供、受者间的混合淋巴细胞反应(MLR)和脾、胸腺嵌合体.结果Ⅲ组供心平均存活时间(85.28±7.48天)较Ⅱ组(7.33±1.03天)显著长(P＜0.01);Ⅱ组供心见大量炎性细胞浸润,Ⅲ组供心仅见少量炎性细胞浸润;Ⅲ组供、受者间MLR较Ⅰ组显著低(P＜0.01);Ⅲ组受者的脾、胸腺形成了稳定的供者细胞嵌合体.结论移植免疫耐受的受者形成了稳定的中枢和外周嵌合体,嵌合体的形成对移植耐受起重要的作用.     

脾肠联合移植对大鼠小肠移植免疫耐受的影响

目的　探讨脾肠联合移植对小肠移植免疫耐受的诱导作用。方法　选用SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体 ,进行异位全小肠和脾脏联合移植。实验分 3组 ,每组 6只。A组 :小肠移植非免疫干预组 ;B组 :受体脾切除 ,脾肠联合移植组 ;C组 :小肠移植环孢霉素A(CsA)治疗组。术后 3、5、7、10d取移植小肠回肠段 0 .5～ 1.0cm进行病理学检查 ,用病理图像分析系统测量黏膜厚度 ,绒毛高度和隐窝深度。采用TdT介导的脱氧核苷酸原位末端标记法 (TUNEL)检测 3、5、7d移植小肠黏膜细胞凋亡 ,评价移植小肠急性排斥反应损伤程度。结果　A、B两组均有不同程度的急性排斥反应损伤 ,但A组高于B组 ,移植后 3、5、7d分别属于轻、中、重度排斥 ,10d黏膜基本完全脱落。B组移植后 3、5d符合轻度排斥 ,7d中度以下排斥 4只 ,重度排斥 2只 ,10d中度排斥 2只 ,重度 4只 ,但仍可见黏膜层。C组移植后 10d 1只出现轻度排斥其余未见明显损伤。黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度B组明显高于A组 ,黏膜上皮细胞凋亡数目较A组低。结论　受体脾切除 ,脾肠联合移植可减轻移植小肠急性排斥反应损伤 ,诱导一定程度的小肠移植免疫耐受     

骨髓细胞胸腺内注射对移植肠CD4、 CD8和CD25的影响

目的 探讨异基因骨髓注射在大鼠小肠移植中的免疫耐受作用和意义.方法 选用近交系大鼠F344/N和Wistar/A进行全小肠异位移植,实验组在异基因移植前7d取供体BMC行受体胸腺内注入,对照单纯同基因及异基因大鼠移植模型了解异基因供体骨髓在受体胸腺内注射能否减少移植后急性排斥反应的发生,观察其生存时间、病理结果及CD4、CD8、CD25的变化.结果 (1)A组移植大鼠平均存活时间为(7.33±1.03) d;B组为(43.76 ±4.57) d;C组为(55.28±7.48)d.(2)异基因大鼠异位全小肠移植术后3、7、15 d可出现典型的轻、中、重度排斥反应,而同基因组和实验组中未出现排斥反应.(3)异基因移植组术后CD4、CD25+,高于其他组(P＜0.05).而CD8的变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 移植术前7d异基因供体骨髓在受体胸腺内注射能显著减少小肠移植后急性排斥反应的发生,并可以抑制移植肠CD4、CD25细胞的表达.     

供体脾细胞胸腺注射对大鼠肢体移植存活的研究

目的 :通过大鼠肢体移植模型 ,旨在分析供体脾细胞注射对大鼠肢体移植中免疫耐受的诱导作用。方法 :选择雄性Wistar和SD大鼠为供、受体 ,对照组为胸腺注射脾细胞培养液 ,实验组为供体脾细胞注射 ,进行了 1 6例异体肢体移植动物实验。观察大鼠移植肢体排斥反应时间及存活时间。结果 :对照组肢体平均存活时间为 ( 9.38± 1 .92 )d ;实验组移植肢体存活时间为 ( 1 5.38± 2 .97)d。结论 :供体脾细胞胸腺注射大鼠肢体移植术后能够明显延长移植肢体的存活时间。     

术中输注供体脾细胞联合术后延迟使用小剂量他克莫司诱导同种异基因大鼠心脏移植免疫耐受

目的观察移植术中经受体门静脉输注供体特异性脾细胞联合术后延迟使用小剂量他克莫司（FK506）对诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受的作用。方法将Wistar大鼠和SD大鼠分为7组,A组至F组分别采用Wistar大鼠和SD大鼠作为供、受体,G组为SD→SD大鼠同基因移植对照。其中A组无任何处理,B组输注供体特异性脾细胞,C组与D组分别早期应用和延迟应用FK506[0.5 mg/（kg.d）],E组与F组既术中经门静脉输注供体脾细胞,又分别早期或延迟应用FK506。采用改良大鼠腹腔异位心脏移植。观察期为术后100 d,观察移植心存活时间及其病理变化。结果 G组移植心均长期存活（100 d）。A~F组存活时间分别为（7.4±0.9）d、（22.1±3.6）d、（8.0±0.8）d、（7.9±1.3）d、（24.4±4.5）d、（95.5±6.0）d。F组7/8移植心长期存活。C组、D组的移植心存活时间与A组比较差异无统计学意义（均为P〉0.05）。与A组比较,B组、E组与F组的移植心存活时间明显延长（P〈0.05~P〈0.01）。而F组移植心存活时间又明显长于B组与E组。病理检查G组移植心心肌未见排斥反应。A组移植心术后9 d表现为3~4级排斥反应,F组存活时间达100 d的大鼠移植心未见排斥反应。结论术中经受体门静脉输注供体脾细胞联合延迟使用小剂量FK506使同种异基因大鼠在移植后早期免疫系统激活后再被抑制,有利于诱导同种移植免疫耐受。     

门静脉输注供者脾细胞诱导的供者特异性免疫低反应性

目的 探讨经门静脉输注供者脾细胞能否诱导皮肤移植小鼠产生供者特异性的免疫低反应性及其可能机制.方法 取Balb/c小鼠,随机分为空白对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液)、受者脾细胞组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞)、供者脾细胞组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞)、空白移植对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验对照组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)以及第三方移植组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C3H小鼠的皮肤).记录空白移植对照组、实验对照组、实验组和第三方移植组移植皮肤的存活时间,并观察移植皮肤的病理学变化;脾细胞输注后7 d,分别获取空白对照组、受者脾细胞组和供者脾细胞组小鼠的外周血、脾脏和肝脏,用流式细胞仪测定样本中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)的比例.结果 实验组移植皮肤的存活时间为(19.8±4.6)d,明显长于空白移植对照组、实验对照组和第三方移植组,但仍未达到长期存活.皮肤移植后7 d,空白移植对照组和实验对照组的移植皮肤呈现重度急性排斥反应的病理学改变,而实验组移植皮肤呈现中度急性排斥反应的病理学改变.供者脾细胞组外周血、肝脏和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例明显高于空白对照组和受者脾细胞组.结论 门静脉输注供者脾细胞可特异性地延长供者皮肤移植物的存活时间,减轻移植物的排斥反应,该效应可能与受者体内的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增加有关.     

供体凋亡/坏死细胞对大鼠脾移植急性排斥反应的作用研究

目的 探讨供体凋亡与坏死细胞对大鼠脾移植急性排斥反应的作用及机制.方法 建立大鼠异位脾移植模型后,随机分为4组:A组输注生理盐水2 ml;B组输注供者凋亡细胞5×106;C组输注正常供体细胞悬液5×106;D组输注5×106坏死细胞.术后不同时间点每组取大鼠8只进行指标测定.结果 移植后脾出现排斥反应并逐渐加重,D组最为严重,A组和C组次之,B组最为轻微.各组移植脾匀浆和受体血清中IFN-γ水平逐步增加,为B组低于A组,而D组高于A组,A组与C组相似.B组大鼠移植脾匀浆和血清中TGF-β水平明显升高,其他各组TGF-β1水平持续于较低水平.凋亡细胞抑制混合淋巴细胞反应,而坏死细胞则作用相反.结论 供体细胞能够影响大鼠脾移植急性排斥反应,可能与细胞因子偏移和受体同种免疫反应性改变有关.     

骨髓输注减轻大鼠肺移植急性排斥反应的研究

目的 研究供体骨髓细胞输注减轻大鼠肺移植急性排斥反应。方法 应用Cuff技术改进大鼠原位单肺移植模型，同时输注供体骨髓细胞，采集受体鼠外周血动态监测嵌合；存活4周大鼠杀死后切取移植肺进行排斥反应分级，切取脾应用免疫组织化学方法检测组织嵌合。结果 流式细胞术在骨髓输注组外周血中检测到明显的嵌合，在脾脏中得到组织嵌合。骨髓输注组移植肺急性排斥反应明显减轻。结论 肺移植同时输注供体骨髓细胞，可以产生显著的供体细胞与受体细胞嵌合，有效地抑制大鼠肺移植急性排斥反应。     

输血诱导免疫耐受对大鼠小肠移植急性排斥反应的影响

目的 观察供体特异性输血(DST)诱导免疫耐受对大鼠小肠移植后急性排斥反应的影响.方法 采用SD至Wistar大鼠异位小肠移植模型,实验组分别予以DST,环孢素(CsA)及DST联合CsA干预,Wistar大鼠同系间移植作为对照,于3、5、7 d观察移植肠管病理变化及受体血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ表达程度.结果 病理显示CsA干预组在7 d出现轻度移植排斥反应;DST联合CsA干预组与对照组结果相似,在3、5、7 d均无明显的移植排斥反应发生.并且DST联合CsA干预组TNF-α表达程度低于单独CsA干预组,在第7天时与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);IFN-γ表达程度低于单独CsA干预组,在第5、7天时与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 异基因大鼠间小肠移植在CsA配合应用的情况下,进行DST可诱导其产生一定的免疫耐受,预防及减轻大鼠小肠移植急性排斥反应的发生及反应程度.     

猪节段性小肠移植免疫耐受的研究

目的 探讨免疫耐受在移植领域的应用前景,建立猪节段性小肠移植免疫耐受模型。方法 １２只幼猪为受者,随机分为实验组及对照组,另选体重相近的异性猪为供者,实验组用供者骨髓细胞预处理,２周后行节段性小肠移植,术后不使用免疫抑制剂;对照组不作预处理。结果 实验组部分移植小肠获长期存活,Ｔ细胞亚群明显下降,外周血白细胞介素（ＩＬ－６均无明显变化,外周血白细胞发现嵌合现象,病理表现为轻度急性排异和慢性排异或无     

酶联免疫斑点技术在心脏移植术后早期诊断急性排斥反应中的作用

目的 探讨酶联免疫斑点技术(ELISPOT)在心脏移植术后早期诊断急性排斥反应中的作用及在供者评估方面的应用价值.方法 采用小鼠腹部心脏移植模型,将实验小鼠分为3组,每组25对.(1)移植排斥组:供者为C57BL/6小鼠,受者为BALB/c小鼠,移植后无特殊处理;(2)实验处理组:供者为C57BL/6小鼠,受者为BALB/c小鼠,受者在移植术前1天经尾静脉输注特异性供者脾细胞,术前1 d及术后1周按每克体重应用环孢素A 5 μg;(3)同系移植组:供、受者均为BALB/c小鼠,移植术后无特殊处理.术后观察移植心存活时间及病理改变;应用ELISPOT技术检测受者脾细胞悬液中供者γ干扰素(IFN-γ)活性分泌细胞频数.结果 移植排斥组和实验处理组移植心平均存活时间分别为(7.8±0.77)d和(14.80±1.01)d,同系移植组存活时间均超过28 d,各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05).移植排斥组与实验处理组和同系移植组相比较,移植心的心肌细胞变性坏死严重,并有大量炎性细胞浸润.移植术后第4天,移植排斥组、实验处理组和同系移植组受者脾细胞悬液中供者特异性IFN-γ活性分泌细胞频数分别为(288±16)个/2×105、(32±10)个/2×105和(6±2)个/2x105;第7天为(416±19)个/2×105、(44±8)个/2×105和(7±2)个/2×105;其与相应的移植心存活时间存在明显负相关,而与术后第7天病理分级存在明显正相关.结论 应用ELISPOT技术检测受者术后早期供者特异性IFN-γ活性分泌细胞频数可作为急性排斥反应的一个早期诊断指标.此技术具有较高的灵敏性与特异性,可用于术前供者配型.     

Different kinetics of donor cell populations after isolated liver and combined liver/small bowel transplantation

Abstract Spontaneous tolerance induction after liver transplantation also supports additional transplants, e. g. a small bowel graft, from the same donor (tolerogenic effect). Chimerism serves as a possible explanation of this phenomenon. Isolated liver (LTx) and combined liver/small bowel transplantation (LSBTx) are compared. LSBTx and LTx were performed in the BN → LEW rat strain combination without immunosuppression. Parenchymal damage during rejection was monitored by sequential standard histology. Donor/recipient populations were identified and further differentiated for immunhistochemical single and double staining. A small number of donor specific leukocytes can be detected on all days in host organs (microchimerism). A significantly larger donor leukocyte population survives long‐term in the sinusoids of liver (graft chimerism). Sinusoidal donor leukocytes survive rejection and recover in number after tolerance induction. Rejection of liver allografts and infiltration by host leukocytes are more pronounced after LSBTx than after LTx. Accordingly, during rejection a steeper decline of sinusoidal donor leukocytes is observed after LSBTx and recovery after tolerance induction is not as marked. Microchimerism apparently plays no significant role in either transplantation model. The number of sinusoidal donor leukocytes, however, mirrors closely host immune responses.     

Augmentation of Transient Donor Cell Chimerism and Alloantigen‐Specific Regulation of Lung Transplants in Miniature Swine

Donor alloantigen infusion induces T cell regulation and transplant tolerance in small animals. Here, we study donor splenocyte infusion in a large animal model of pulmonary transplantation. Major histocompatibility complex–mismatched single lung transplantation was performed in 28 minipigs followed by a 28‐day course of methylprednisolone and tacrolimus. Some animals received a perioperative donor or third party splenocyte infusion, with or without low‐dose irradiation (IRR) before surgery. Graft survival was significantly prolonged in animals receiving both donor splenocytes and IRR compared with controls with either donor splenocytes or IRR only. In animals with donor splenocytes and IRR, increased donor cell chimerism and CD4⁺CD25^high+ T cell frequencies were detected in peripheral blood associated with decreased interferon‐γ production of leukocytes. Secondary third‐party kidney transplants more than 2 years after pulmonary transplantation were acutely rejected despite maintained tolerance of the lung allografts. As a cellular control, additional animals received third‐party splenocytes or donor splenocyte protein extracts. While animals treated with third‐party splenocytes showed significant graft survival prolongation, the subcellular antigen infusion showed no such effect. In conclusion, minipigs conditioned with preoperative IRR and donor, or third‐party, splenocyte infusions may develop long‐term donor‐specific pulmonary allograft survival in the presence of high levels of circulating regulatory T cells.     

输注供体骨髓细胞诱导大鼠小肠移植基因嵌合的研究

目的 探讨经门静脉途径输注供体骨髓细胞后,大鼠小肠移植中受体基因嵌合率的改变及可能机制.方法 建立大鼠异位节段小肠移植模型(供体为雄性BN,受体为雌性Lewis,各15只),并将其随机分为三组,对照组、FK506组、PV组(喂养FK506及经门静脉注射供体骨髓细胞组).应用原位荧光杂交定位检测以及实时定量聚合酶链反应技术分析供体雄性细胞的SRY基因在移植术后受体大鼠血液、肝脏及脾脏中的嵌合情况.结果 PV组受体雌性大鼠血液(3.03±0.16)%、肝脏(0.86±0.05)%、脾脏(4.08±0.12)%中供体SRY基因嵌合率均较FK506组(1.15±0.07)%、(0.21±0.02)%、(1.23±0.05)%、对照组(1.10±0.07)%、(0.22±0.02)%、(1.17±0.06)%明显增高(P＜0.01).结论 经门静脉系统输注供体骨髓细胞可建立稳定的混和嵌合体状态.     

紫杉醇在大鼠原位肝移植中的作用及其对细胞毒性T淋巴细胞实验的影响

目的观察紫杉醇在大鼠原位肝移植中的作用及其对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的影响。方法建立Wistar→SD大鼠肝移植的急性排斥模型。将大鼠分为对照组(阻断全肝血流)、急排组(Wistar→SD肝移植)、紫杉醇组(Wistar→SD肝移植,紫杉醇腹腔注射0.75mg·kg-1·d-1,观察生存时间、病理改变、生化指标及CTL、T淋巴细胞凋亡情况。结果紫杉醇组大鼠的术后存活时间高于急排组,[(18.2±1.5)dvs(8.8±1.9)d,P0.01)。急排组的HE评分(Banff)高于紫杉醇组(7.80±0.83vs4.80±0.82,P0.01)。紫杉醇组的白蛋白水平高于急排组(P=0.003);紫杉醇组的谷丙转氨酶水平低于急排组(t=25.23,P0.01)。CTL检测中,急排组的特异性杀伤靶细胞的百分率均高于紫杉醇组(P0.01)。急排组的T淋巴细胞的凋亡率低于紫杉醇组[(7.16±1.56)%vs(16.47±2.51)%,P0.01]。结论紫杉醇在大鼠肝移植中具有免疫抑制作用,可能通过诱导T淋巴细胞凋亡来抑制T淋巴细胞的活化发挥作用。     

Long‐term small bowel allograft function induced by short‐term FK 506 application is associated with split tolerance

Abstract Functional long‐term allograft survival after experimental small bowel transplantation (SBT) is limited by chronic rejection. Initial application of high‐dose FK 506 has been shown to induce stable long‐term graft function. In order to examine whether this long‐term function is associated with donor‐specific tolerance, we analyzed the functional status of recipient T cells in vivo and in vitro. One‐step orthotopic SBT was performed in the allogeneic Brown Norway (BN)‐to‐Lewis rat strain combination. FK 506 was given daily at a dose of 2 mg/kg from days 0‐5 in the rejection model and from days 0‐9 in the long‐term functional model. Mean survival time in the rejection model was 98 ± 2.8 days. Histological examination of these small bowel allografts disclosed signs of chronic rejection. In contrast, all animals of the long‐term functional model survived long term (> 250 days) without clinical signs of chronic rejection. The latter model, furthermore, produced evidence of donor‐specific tolerance. Whereas heterotopic Dark Agouti (DA) hearts were rejected regularly within 7 days, BN hearts survived indefinitely (> 70 days). In vitro, mixed leukocyte reactivity of CD4 + T cells was similarly strong against donor (BN) antigens as against third‐party (DA) antigens. The split tolerance revealed by our in vivo and in vitro results enabled acceptance of both the small bowel allograft without signs of chronic rejection and of donor‐specific heart allografts.     

器官移植术后的嵌合现象

为研究器官移植术后的嵌合现象，术后利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测３例接受男性供体器官的女性受者外周血及皮肤组织中的Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段。结果在１例小肠移植受者的外周血及皮肤组织中出现Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段；２例肾移植受者的外周血中也出现Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段。表明在器官移植术后存在着供体细胞向受体组织的移行嵌合。认为促进嵌合的出现及保持嵌合的平衡，将有利于防治排斥反应和移植物抗宿主病。