结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的 探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值.方法 应用定量逆转录聚合酶链反应（RT.PCR）对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、30、60 d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法（CFU）作比较.结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2 d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14 d阴性的12例,治疗30 d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60 d时全部阴性.结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标.     

结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的　探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值。方法 应用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、306、0d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法(CFU)作比较。结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14d阴性的12例,治疗30d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60d时全部阴性。结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标。     

2月末结核分枝杆菌阳性初治肺结核患者菌型鉴定结果分析

目的分析深圳市南山区2月末结核分枝杆菌阳性肺结核患者的分枝杆菌分布情况,为诊断与治疗分枝杆菌感染提供参考依据。方法 2013年1月至2015年12月深圳市南山区痰结核分枝杆菌阳性的初治肺结核患者治疗2月末仍结核分枝杆菌阳性患者进行菌型鉴定并进行结果分析。结果 617例结核分枝杆菌阳性肺结核患者经2个月强化期治疗后,46例患者出现2月末结核菌阳性,其中涂片阳性为33例,涂片阴性而培养阳性为13例;涂片阳性患者中19例培养阴性,10例为结核药物敏感菌,4例为非结核分枝杆菌;涂阴培阳患者中1例为结核药物敏感菌,12例为非结核分枝杆菌;16例非结核分枝杆菌经分型鉴定后,7例脓肿分枝杆菌,9例戈登分枝杆菌。结论肺结核患者可能继发非结核分枝杆菌感染,抗结核治疗2月末肺结核病人应及时留取痰标本做结核菌涂片,培养和菌种鉴定,为进一步诊断和制定个体化疗方案提供依据。     

mRNA定量分析作为结核分支杆菌活菌检测标志的研究

目的 探讨mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性。方法 采用定量PCR方法结核分支杆菌H37RV在利福平，异烟肼，乙胺丁醇，链霉素，氧氟沙星处理后24，48，72h85BmRNA表达水平的变化并与活菌计数方法作对比。结果 利福平处理24h后85BmRNA下降到无药对照的0．02％，其他药物处理分别下降到无药对照的1％－10％，各药处理72h后85BmRNA均下降到1％以下。结论 mRNA表达水平可以在短时间内反映出结核分枝杆菌用药与无药的区别，并与菌落形成单位（CFU）几乎呈平行关系。mRNA是检测和判定结核分枝杆菌“死”“活”的分子标志物，是反映细菌对药物敏感性的指标。     

应用蛋白芯片技术快速诊断肺结核病的研究

目的评价结核分枝杆菌蛋白芯片在检测临床标本中结核分枝杆菌抗体的应用价值。方法应用结核分枝杆菌蛋白芯片检测117例结核病患者的血清标本、103例肺部其他疾病患者和健康入的血清标本，并与痰涂片镜检法相比较。结果在菌阳肺结核、菌阴肺结核中，结核分枝杆菌抗体芯片检测的阳性率分别是100％（26／26）、49．6％（45／91），在肺部其他疾病患者和健康人中，结核分枝杆菌抗体芯片检测的阴性率是98．1％（101／103）。结论结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片是一种集基因工程技术、芯片技术和免疫学技术的检测一体化的新型结核病快速诊断方法，具有简便、快速、大量、敏感性高和特异性强、检测成本较低的特点，是结核病、尤其是菌阴结核病辅助诊断的有效方法。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

纤维支气管镜检查对无痰或痰菌阴性不典型肺结核的诊断价值

目的 探讨纤维支气管镜（简称“纤支镜”）检查对无痰或痰菌阴性不典型肺结核的诊断价值。 方法 选无痰或痰菌阴性的不典型肺结核患者201例,用纤支镜在病变部位进行活检、刷检、支气管肺泡灌洗液（BALF）进行BBLMGIT(Mycobacteria Growth Indicate Tube)分枝杆菌快速培养查结核杆菌。术后进行痰涂片查抗酸杆菌、痰结核分枝杆菌快速培养。 结果201例刷检、BALF快速培养结核分枝杆菌阳性率分别是67.2%、83.6%,61例活检阳性率63.9%,201例术后痰涂片、术后痰快速培养结核分枝杆菌阳性率分别是28.9%、57.2%。 结论 纤支镜检查是确诊无痰或痰菌阴性不典型肺结核的有效方法 ,其中BALF行结核分枝杆菌快速培养具有较高的诊断价值、快速、阳性率较高。根据镜下所见采用不同的取材方法 可望提高诊断率。     

应用磁纳米捕获-PCR技术检测痰液结核分枝杆菌的研究

目的采用磁纳米捕获技术富集痰液中的结核分枝杆菌,以提高PCR检测的灵敏度,快速诊断结核病。方法以普通PCR为对照,采用磁纳米捕获技术富集187份结核和非结核呼吸系统疾病患者痰标本中的结核分枝杆菌,进行PCR检测。结果 152份肺结核患者痰标本41份(27.0%)涂片抗酸染色阳性,72份(47.4%)普通PCR检测阳性,126份(82.9%)磁纳米捕获-PCR检测阳性。35份非结核呼吸系统疾病患者,痰标本中抗酸染色均为阴性,1份普通PCR和磁纳米捕获-PCR检测均阳性,该患者临床诊断肺部感染合并陈旧性肺结核。结论采用磁纳米捕获技术富集痰液中的结核分枝杆菌,可显著提高PCR检测的灵敏度。     

应用蛋白芯片技术快速诊断肺结核病的研究

目的评价结核分枝杆菌蛋白芯片在检测临床标本中结核分枝杆菌抗体的应用价值。方法应用结核分枝杆菌蛋白芯片检测117例结核病患者的血清标本、103例肺部其他疾病患者和健康人的血清标本,并与痰涂片镜检法相比较。结果在菌阳肺结核、菌阴肺结核中,结核分枝杆菌抗体芯片检测的阳性率分别是100%(26/26)、49.6%(45/91),在肺部其他疾病患者和健康人中,结核分枝杆菌抗体芯片检测的阴性率是98.1%(101/103)。结论结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片是一种集基因工程技术、芯片技术和免疫学技术的检测一体化的新型结核病快速诊断方法,具有简便、快速、大量、敏感性高和特异性强、检测成本较低的特点,是结核病、尤其是菌阴结核病辅助诊断的有效方法。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy.

Effective treatment regimens for pulmonary tuberculosis are difficult to assess because of the slow growth rate of Mycobacterium tuberculosis in culture and its protracted clearance from sputum. A rapid method that reflects effective antimicrobial activity would markedly advance evaluation of treatment and promote the assessment of new antituberculosis drugs. Conventional methods measure the progressive reduction of numbers of acid-fast bacilli in the sputum smear and the clearance of organisms in sputum culture. In this study, we measured levels of M. tuberculosis 85B (alpha antigen) messenger RNA (mRNA), 16S ribosomal RNA (rRNA), and IS6110 DNA in patients' sputa to ascertain whether they could serve as potential surrogate markers of response to chemotherapy. Sputum specimens were sequentially collected for up to a year from 19 smear-positive pulmonary tuberculosis patients receiving an optimal drug treatment regimen. Nucleic acids were isolated from these specimens, and two M. tuberculosis molecular targets (mRNA, DNA) were quantified, using the ABI Prism 7700 Sequence Detection System. The Mycobacterium genus-specific 16S rRNA was quantified with a limiting dilution RT-PCR assay. Results show that levels of 85B mRNA declined after initiation of therapy, as did viable M. tuberculosis colony counts, with 90% of patients becoming negative for both markers after 2 mo of treatment. The rapid disappearance of M. tuberculosis mRNA from sputum suggests that it is a good indicator of microbial viability and a useful marker for rapid assessment of response to chemotherapy.     

DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的研究结核分枝杆菌DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3d开始,分别用生理盐水（A组）、pVAX1载体（B组）、利福平（C组）、HSP65 DNA疫苗（D组）、Ag85A DNA 疫苗（E组）、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗（F组）治疗60d,DNA疫苗每隔15d肌肉注射1次,共5次。治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀。与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50 和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46 和0.28 logs（P<0.05,P<0.01）。结论Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

新疆地区结核分枝杆菌北京/W系和非北京/W系间五种重要蛋白表达差异的初步研究

目的 检测北京/W系和非北京/W系结核分枝杆菌HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64在基因、mRNA和蛋白水平有无差异,探讨5个重要蛋白对于北京/W系菌株广泛流行的可能作用。方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,其中北京/W系与非北京/W系菌株各30株,运用DNA直接测序法检测北京/W系和非北京/W系菌株HspX、Hsp65、38 kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物,采用实时定量PCR技术检测细菌在对数生长期5个重要蛋白的编码基因mRNA的表达水平,使用Western blot技术检测细菌感染巨噬细胞24 h后5个蛋白在不同菌株中的表达水平。结果统计分析采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物测序均未发现突变。HspX、Hsp65在北京/W系菌株中的mRNA在对数生长期的表达差异均无统计学意义(P>0.05),而在感染巨噬细胞24 h后,细菌中两个热休克蛋白的表达高于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05)。在细菌感染细胞前后,北京/W系菌株中38 kDa、Ag85B的mRNA和蛋白水平的表达均低于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05)。MPT64在mRNA和蛋白水平的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 与非北京/W系菌株比较,北京/W系菌株中HspX、Hsp65高表达,38 kDa、Ag85B表达较低,推测这几个蛋白表达的改变可能与北京/W系菌株的流行有一定的关系。     

Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病疗效的实验研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病的效果。方法用结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉注射50只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、草分枝杆菌F.U.36注射液(D组)、Ag85A/B嵌合DNA疫苗(E组)治疗,每2周肌肉注射1次DNA疫苗,共3次。在治疗结束后2周,杀鼠,取小鼠肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果与A组比较,D组、E组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰,细胞分布均匀。与A组相比,C、D、E组肺脏菌落数依次减少2.11 log、0.76 log、0.81 log;肝脏菌落数依次减少2.11 log、0.74 log、1.11 logs(P0.01)。结论 Ag85A/B嵌合DNA对小鼠敏感结核病具有较好的治疗效果。     

结核分枝杆菌DNA三价苗的细胞与体液应答研究

本文构建了含分枝杆菌抗原Ag85B(30kDa) ,MPT - 83(2 6kDa)和ESAT - 6 (6kDa)分泌蛋白的真核表达载体pJW 4 30 3,酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,证明上述三种重组质粒能在COS7细胞中表达出特异蛋白。三种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠 ,首免 ,二免和三免小鼠后 2 1dAg85B抗体平均滴度分别为 1∶32 0 0 ,1∶5 12 0 0和 1∶10 2 4 0 0 ,MPT - 83抗体平均滴度二次免疫和三次免疫后 2 1d测得为 1∶2 5和 1∶5 0 ,三次免疫后均未检测到ESAT - 6特异性抗体。在三免后 2 1dAg85B和MPT - 83的特异性细胞因子γ -干扰素的浓度分别 2 75 pg/ml±16 5 ,2 2 0 pg/ml± 19 8;而ESAT - 6的γ -干扰素浓度为 2 2 0 pg/ml± 9 9。本研究表明 ,多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答 ,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。     

The role of simultaneous combination culture with solid and liquid media for diagnosis of pulmonary tuberculosis

PURPOSE: To study the usefulness of simultaneous combination culture with egg-based Ogawa medium (1 slant) and MGIT (Mycobacterium growth indicator tube/Becton-Dickinson) for detection of M. tuberculosis from sputum in sputum-culture proven pulmonary tuberculosis patients. OBJECT AND METHOD: Retrospective study of sputum-culture-positive pulmonary tuberculosis cases in our hospital (with tuberculosis ward) from Jan. 2002 to Sept. 2003. RESULT: In 1103 sputum culture for the diagnosis of 370 sputum-culture proven pulmonary tuberculosis cases, 86.0% were MGIT positive and 79.5% were Ogawa positive. Among sputa contaminated on MGIT, 56.1% (23/41) were positive on Ogawa. Among sputa culture-negative on MGIT, 2.7% (3/113) were positive on Ogawa. Those 3 sputa were obtained from 3 different patients, and in 2 of them, other sputa were positive on MGIT. Frequency of "M. tuberculosis strain which can be cultured only by Ogawa" was supposed to be at maximum 0.27% (1/370). Of 41 sputa contaminated on MGIT, 15 sputum specimens were re-treated and re-cultured by MGIT. Of these specimens 46.7% (7/15) were positive on Ogawa, and 73.3% (11/15) were positive on re-treated MGIT, and the difference was not statistically different. CONCLUSION: From the standpoint of detection of M. tuberculosis from sputum in sputum-culture proven pulmonary tuberculosis patients, simultaneous combination culture of Ogawa medium with MGIT is useful, mainly for risk management of MGIT contamination. But, if re-treated MGIT is done for cases of contaminated on MGIT, simultaneous combination culture of Ogawa medium with MGIT is not necessary.     

糖尿病合并肺结核54例临床分析

目的　探讨糖尿病合并肺结核的临床特点。方法　同期选取 5 4例糖尿病合并肺结核患者 (A组 )与6 0例非糖尿病肺结核患者 (B组 ) ,以同一抗痨方案治疗 ,比较两组病例的临床症状、胸部 X线表现、实验室检查及治疗效果。结果　 1、A组较 B组起病急、症状重 ,以干酪病灶为主 ,病变范围广 ,易于溶解形成空洞 ,痰菌阳性率高 ,起病进展恶化快。 2、A组痊愈率、好转率、痰菌阴转率均低于 B组 (P<0 .0 5 )。结论　严格控制血糖水平、加强抗痨治疗有助于改善糖尿病合并肺结核患者的预后