SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

Robo1RNA干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的 构建Roundabout (Robo1) siRNA慢病毒载体,并在SKOV3卵巢癌细胞中鉴定其转染及基因沉默效果.方法 根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备Robo1 DNA片段,在T4 DNA连接酶作用下,将线性化的病毒载体GV118与DNA片段制备合成GV118-siRNA目的 质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒载体在工具细胞SKOV3卵巢癌细胞中的转染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot方法 检测Robo1 siRNA慢病毒对SKOV3中Robo1的干扰作用.结果 成功构建Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,病毒滴度为2×109 TU/mL;用该病毒体外转染SKOV3卵巢癌细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blot方法 检测Robo1基因沉默的效率分别为76.7%、56.0%.结论 成功构建了Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该病毒载体在体外转染SKOV3卵巢癌细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

慢病毒载体对HIF-2α基因沉默效率的研究

目的 构建有效抑制HIF-2α基因表达的siRNA序列,并找到最佳病毒载体浓度.方法 设计针对HIF-2α mRNA作用的4条siRNA的序列,分别插入慢病毒载体中,获得较高滴度的慢病毒后,运用RT-PCR和Werstern blot方法检测HIF-2α mRNA及蛋白质水平,筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量.结果 4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(P<0.05).两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(P＜0.05).结论 KD2序列能有效沉默HIF-2α基因;高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强.     

靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒载体构建及病毒包装

目的包装表达TIPE2-shRNA的慢病毒颗粒。方法查询并合成7对针对TIPE2的shRNA序列,将其克隆入pLK0.1载体,经酶切及测序正确后,将构建好的7种pLKO.1-TIPE2-shRNA质粒分别与pCDNA3.1/3×FLAG-TIPE2共转染293T细胞,Western blot鉴定干扰效率并进行后续的病毒包装。结果 4号质粒沉默效果最好,将其与Non-target-shRNA质粒分别进行病毒包装,Western blot和免疫荧光证实病毒具有良好的感染效率和沉默效果。结论 TIPE2-shRNA的慢病毒载体构建及病毒包装成功。     

pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响

目的:构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响. 方法:采用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因,连接T 载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定后转染入HEK293细胞中,利用荧光显微镜和Western Blot进行表达鉴定,最后转染人牙龈成纤维细胞,通过MTT实验观察转染hBMP2后对人牙龈成纤维细胞增殖特性、ALP活性、OC含量、体外矿化能力的影响. 结果:成功克隆了人BMP2基因,酶切鉴定及测序均正确,真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2能正确表达hBMP2蛋白,hBMP2对人牙龈成纤维细胞增殖特性无影响,但可增强其ALP活性、OC含量及体外矿化能力. 结论:构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该基因可促进人牙龈成纤维细胞向成骨细胞方向分化.     

BMP2基因重组慢病毒载体质粒的构建及鉴定

目的构建重组慢病毒载体质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP-2/T2A/EGFP并进行鉴定。方法从Genbank获得BMP2基因序列,结合载体上的酶切位点需要,设计上下游引物,通过PCR方法扩增目的基因片段,利用Gateway技术BP反应构建pDown-BMP2-T2A-EGFP,并进行阳性克隆测序,应用LR反应把pDown-BMP2-T2A-EGFP重组入慢病毒目的载体质粒pLV.Des2d.P/neo,进行阳性克隆测序。结果获得长度为1 191bp的BMP2目的基因片段,质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP2/T2A/EGFP经双酶切后凝胶电泳鉴定正确,测序结果与Genbank报道序列一致。结论成功构建重组慢病毒载体质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP2/T2A/EGFP。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

PRMT2慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)慢病毒表达载体。方法通过PCR扩增PRMT2 c DNA,将PRMT2 c DNA连接于GV308载体,经测序确认后,将GV308/PRMT2与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将PRMT2慢病毒表达载体侵染293T细胞,通过四环素诱导和Western blot检测PRMT2慢病毒表达载体的表达能力。结果在感染PRMT2慢病毒载体293T细胞中能检测到PRMT2-3Flag融合蛋白的表达。结论成功构建PRMT2的慢病毒表达载体。     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW.方法 Xho Ⅰ线性化pLentiEF1a-SOx2-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho Ⅰ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.356 kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUSGW.获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系.结果 酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带SOx2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87.结论 成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础.     

MMP-2基因RNAi重组慢病毒的构建

目的 构建MMP-2基因RNAi重组慢病毒,以便客观研究该基因的作用.方法 筛选确定的MMP-2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2siMMP-2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV2siMMP-2,pCMV2dR8.74和pMD2G3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建MMP-2 siRNA的慢病毒载体LV2siMMP-2,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×1010 TU/L.结论 成功构建人MMP-2基因RNAi慢病毒载体,为后期研究MMP-2基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗奠定基础.     

Runx2蛋白与成骨细胞分化信号

Runx2蛋白在成骨细胞的分化和骨形成方面起重要的作用。Runx2通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路使其磷酸化调节其活性和功能,Runx2蛋白参与了多种信号转导途径,细胞外基质、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、力学刺激、甲状旁腺激素等信号途径均对Runx2的活性有一定的影响;另外,许多因子作为Runx2的上游调节因子对Runx2的活性起调节功能,同时Osxter做为Runx2的下游靶基因其功能受Runx2的严格控制。Runx2蛋白在成骨细胞分化的多种信号途径中起中心作用。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

Runx1基因mRNA表达与非小细胞肺癌发生及淋巴转移的相关性研究

目的:探讨Runx1基因mRNA表达与人非小细胞肺癌(NSCLC)发生、发展的关系.方法:取37例NSCLC标本,10例肺良性病变旁正常肺组织,应用逆转录-多聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测NSCLC中Runx1的mRNA表达水平,进行统计分析.结果:肺癌肿瘤组织中Runx1基因表达水平显著低于肺良性病变旁正常肺组织(P＜0.01),肺癌组织中Runx1基因表达水平降低与淋巴结转移相关(P＜0.05),与肺癌组织学类型、细胞分化程度以及患者的年龄、性别无关(P＞0.05).结论:与良性病变旁正常肺组织相比,Runx1基因的mRNA水平在肿瘤组织中表达下降,并且与淋巴结转移相关,提示其可能参与肺癌的发生发展过程.     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

沉默Calnexin基因表达对胃癌细胞SGC-7901内质网应激凋亡及其信号通路的影响

目的探讨沉默钙连蛋白（Calnexin）基因对胃癌细胞SGC-7901内质网应激凋亡信号通路的影响。方法构建靶向Calnexin基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,转染人胃癌SGC-7901细胞,并分为转染shRNA-Calnexin的实验组,转染shRNA空白质粒的空白载体组,并将未转染的SGC-7901细胞作为对照组。应用RT-PCR技术检测靶向沉默Calnexin的表达,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Westernblot检测GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表达水平。结果转染shRNA沉默Calnexin基因可明显下调CalnexinmRNA的表达,实验组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;MTT法检测实验组细胞转染后细胞增殖能力明显下降（P＜0.05）;沉默Calnexin基因可提高细胞凋亡率,转染72h后实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;沉默Calnexin基因使胃癌细胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）。结论靶向沉默Calnexin基因抑制人胃癌细胞增殖和促进细胞凋亡可能是通过抑制内质网应激信号通路实现的。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。