家鸡MDH2基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体构建

目的 初步探索家鸡苹果酸脱氢酶2编码基因MDH2的序列特征、组织表达及原核表达情况。方法 采用克隆技术与测序技术获取家鸡MDH2基因互补脱氧核糖核酸（cDNA）全长，使用多种在线软件对其进行生物信息学分析，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术检测该基因在不同组织中的表达情况，利用同源重组技术构建pET32a（+）-MDH2表达载体，使用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。结果 从新鲜家鸡砂囊内壁中成功克隆到MDH2基因，序列长度1120 bp，其开放阅读框（ORF）为1014 bp，编码337个氨基酸；MDH2蛋白相对分子质量为35.95 kDa，理论等电点9.17，属于稳定碱性疏水性蛋白。MDH2蛋白含25个磷酸化位点；二级结构主要包括α-螺旋、β-螺旋、无规则卷曲，无信号肽和跨膜结构域。MDH2基因在心、肝、脾、肺、肾、砂囊内壁中都有表达，其中心、肾、砂囊内壁中表达量较高，pET32a（+）-MDH2重组蛋白主要是以包涵体的形式存在。结论 MDH2基因在家鸡体内广泛表达，但其在各组织/器官中表达趋势不同，提示其功能可能具有广泛性与多重性。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因克隆与原核表达分析＊

目的 克隆霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因并进行生物信息学分析，为进一步培育高黄酮含量的霍山石斛药材提供理论依据。方法 根据前期霍山石斛转录组数据筛选出的基因DhUF3GT，克隆该基因，并对cDNA的核酸序列进行生物信息学分析，同时构建DhUF3GT-pET28（a）重组质粒进行原核表达分析。结果 测序结果显示，霍山石斛DhUF3GT基因cDNA序列有1289 bp，包含一个长度为1239 bp的开放阅读框，编码412个氨基酸，GenBank中的登录号为OM460827。生物信息学分析表明：DhUF3GT蛋白属于亲水性稳定蛋白，理论相对分子质量为45.668 KD，等电点（PI）为5.98，具有多个磷酸化位点和两个糖基化位点，不含信号肽，亚细胞定位于叶绿体。系统进化树表明，该序列与同科植物铁皮石斛同源性最高，具有UGT家族的“PSPG Box”保守区域。SDS-PAGE电泳显示，成功表达出原核重组蛋白DhUF3GT-pET28（a）。结论 成功克隆出霍山石斛DhUF3GT基因序列，并获得其序列特征及原核表达蛋白，这有助于霍山石斛DhUF3GT功能的进一步研究及类黄酮化合物的生物合成机制的阐明。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。     

桑黄麦角甾醇生物合成关键酶PlERG24基因克隆与表达分析

目的 克隆桑黄菌丝甾醇C14还原酶（ERG24）基因全长,并进行生物信息学及表达模式的初步分析。方法 基于桑黄菌丝转录组数据设计PlERG24基因引物,采用PCR技术获得其cDNA全长序列,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式。结果 从桑黄菌丝中克隆到1 412 bp的PlERG24基因,开放阅读框长度为1 326 bp,编码441个氨基酸,理论相对分子质量为49 358.61,等电点为5.28,为不含信号肽的疏水性蛋白,推测定位于质膜,具有6个磷酸化位点;系统进化树分析表明,该序列与暴马桑黄的ERG24基因同源性最高。表达模式分析表明,在桑黄菌丝生长的一个周期内,PlERG24基因表达在25 d时达到最高6.36。结论 获得了PlERG24基因全长序列,为进一步研究该基因的功能以及利用基因工程等手段改良麦角甾醇生物合成途径奠定基础。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

荆芥柠檬烯-3-羟化酶基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆荆芥（Schizonepeta tenuifolia）中的柠檬烯-3-羟化酶基因（limonene-3-hydroxylase,StL3OH）,并对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析。方法 根据荆芥转录组数据库设计特异性引物,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术克隆StL3OH基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析。结果 荆芥StL3OH基因的cDNA序列长为1 598 bp,包含1个长度为1 497 bp的完整开放阅读框,编码498个的氨基酸,其StL3OH蛋白理论相对分子质量为56.40 kDa,为亲水性不稳定蛋白。生物信息学分析表明,StL3OH蛋白无信号肽,具有1个跨膜区,可能定位于内质网膜上。多重序列比对和聚类分析表明,荆芥StL3OH蛋白与植物留兰香柠檬烯-3-羟化酶蛋白（MsL3OH）的氨基酸序列高度相似,均含有细胞色素P450血红素结合区,属于细胞色素CYP71家族中的D亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以鸟嘌呤/胞嘧啶（G/C）结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论 首次从荆芥中克隆得到StL3OH基因的cDNA序列,为下一步研究StL3OH蛋白的结构与功能和该基因在荆芥单萜类成分的累积与生物合成的调控机制提供依据。     

珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11克隆与盐胁迫表达分析＊

目的 鉴定珊瑚菜抗盐基因GlERF11并分析其在盐处理下的表达量变化。方法 对GlERF11基因进行全长克隆以及生物信息学分析，使用荧光定量PCR方法对GlERF11基因进行定量表达分析。结果 GlERF11基因cDNA全长1019 bp，开放阅读框全长537 bp，编码178个氨基酸。生物信息学分析显示，GlERF11蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，相对分子质量为19710.95 Da，包含AP2超家族保守结构域。系统进化树分析显示，GlERF11蛋白与伞形科植物胡萝卜ERF11蛋白亲缘关系较近。荧光定量分析显示，珊瑚菜幼苗的GlERF11基因受盐胁迫影响后表达量均有所提高，处理后12 h变化最为显著。结论 本研究针对珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11开展生物信息学分析，研究为珊瑚菜品种改良以及育种提供了重要的理论基础与思路。     

北沙参异戊烯基转移酶GlIPT1基因的克隆及生物信息学分析＊

目的 挖掘参与北沙参（Glehniae Radix）香豆素合成的关键酶异戊烯基转移酶（Isoprenyltransferase，IPT）基因，进一步分析该基因的序列特征及表达量模式。方法 本研究摸索了一种北沙参基原植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）无菌苗制备方法，并且在珊瑚菜转录组测序数据的基础上，使用茉莉酸甲酯（MeJA）处理筛选出表达量上调的候选基因序列；利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术对GlIPT1基因cDNA序列进行全长克隆；根据所得的氨基酸序列进行蛋白质理化性质、二级结构、三级结构分析；利用Clustalx及MEGA 6.0构建NJ系统进化树；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测该基因的组织特异性表达。结果 GlIPT1基因cDNA序列全长为1296 bp，编码306个氨基酸残基，蛋白相对分子质量为34409.30 Da，等电点为5.93，属于P-loop_NTPase超家族，为亲水性蛋白。系统进化分析表明，GlIPT1与伞形科植物胡萝卜Daucus carota subsp. sativus IPT蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示：GlIPT1基因在珊瑚菜的花中表达量最高，其次是根，在叶中表达量较低。结论 本实验为进一步研究北沙参的分子育种和利用生物技术提高香豆素产量奠定了基础，具有重要的理论价值和良好的应用前景。     

人参AGO1基因的克隆及序列分析

目的: 从人参叶片中克隆Argonaute 1(PgAGO1)的全长基因,并利用生物信息学方法进行分析。 方法: 根据人参EST序列设计特异性引物,采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长,并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。 结果: 克隆的PgAGO1全长cDNA为3 776 bp,其中包括5'UTR 204 bp,3'UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放阅读框,可编码1 105个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为122.22 kDa,理论等电点pI 9.71;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高,在根中最低。 结论: 从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析

目的对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1(SQE1)基因进行全长c DNA克隆和功能分析。方法基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长c DNA,并进行生物信息学分析。利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响。结果获得太子参SQE1基因全长c DNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株。结论首次克隆获得太子参SQE1基因的全长c DNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据。     

珊瑚菜GlPS1、GlPS2基因克隆及表达分析

目的克隆珊瑚菜Glehnia littoralis补骨脂素合成酶(psoralen synthase,PS)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学和表达量分析。方法在前期珊瑚菜转录组测序的基础上,筛选出表达量较高的2条PS基因GlPS1和GlPS2序列。利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法对2个基因cDNA序列3’端进行克隆,DNAMAN拼接后得到基因全长cDNA序列,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlPS1和GlPS2基因的组织特异性表达。结果 GlPS1和GlPS2基因cDNA序列全长分别为1 885 bp和1 971 bp,编码495和502个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为55 740.7和56 363.9,等电点为8.28和6.62,均属于细胞色素P450超家族,含有1个跨膜区,为亲水性蛋白。系统进化分析表明,GlPS1和GlPS2与伞形科欧防风Pastinaca sativa、旱芹Apium graveolens、大阿米芹Ammi majus PS蛋白亲缘关系较近。RT-qPCR结果显示GlPS1基因在根中表达量较高,在叶中表达量较低,而GlPS2基因在花中表达量较高,在根中表达量较低。结论首次获得珊瑚菜GlPS1和GlPS2基因的全长cDNA序列并进行了表达分析,为进一步开展珊瑚菜补骨脂素合成酶基因的功能和遗传调控机制研究奠定基础。     

光果甘草ARPI基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆光果甘草生长素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAA)(GgARPI)基因并进行生物信息学分析。方法:取光果甘草新鲜主根,提取RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆GgARPI基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列,测序并对其进行生物信息学分析。结果:克隆得到长度为686 bp的GgARPI基因cDNA序列,包含1个585 bp的完整开放阅读框(ORF),编码194个氨基酸残基。生物信息学分析表明GgARPI编码蛋白为稳定亲水蛋白,相对分子质量21. 95 k Da,等电点6. 85,不含信号肽,无跨膜区,二级结构以无规卷曲为主,包含1个Aux/IAA蛋白超家族结构域。同源性分析表明GgARPI基因与豆科植物的亲缘关系较近,与单子叶植物谷子Setaria italica的进化关系最远。结论:首次克隆得到GgARPI cDNA序列,为进一步研究GgARPI基因的功能及其对甘草酸生物合成的分子调控机制奠定了基础。     

川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定位及表达分析

根据川牛膝基因组数据提供的基因序列合成特异性引物,利用常规PCR方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆川牛膝Obg C(Gene Bank登录号KU847910)全长cDNA序列,克隆获得2 226 bp全长CoObgC序列,开放阅读框为1 818 bp,编码605个氨基酸序列,预测CoObgC蛋白相对分子质量为66.39 k Da,等电点p I 5.35,为稳定蛋白,并进行多重序列比对和构建系统进化树分析。以川牛膝actin为内参,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CoObgC基因在川牛膝根、茎、叶、花4种组织中表达特征,结果显示在叶片中表达丰度最高,其次为根、花、茎;构建p CABIA2300-CoObgC重组载体,利用农杆菌介导法在烟草中进行瞬时表达,激光扫描共聚焦显微镜观察显示川牛膝CoObgC定位于叶绿体。该研究为进一步解析Obg基因的结构和功能,开展川牛膝分子生物学研究奠定基础。