蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果 PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性,建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间,并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点,根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R,分别采集地龙及其混伪品,建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系,对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃,循环次数为36次,地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后,可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分,准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原,也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

五倍子配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的:为保障临床用药的安全性和有效性,建立五倍子药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法。方法:根据五倍子细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列设计引物,筛选出五倍子的稳定引物区间,并在区间内筛选获得五倍子的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,根据SNP位点设计五倍子特异性鉴别引物WBZ-F、WBZ-R,分别收集五倍子及其混伪品,建立五倍子配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR体系,对该方法进行耐受性和适用性考察。结果:退火温度为53℃,循环36次,五倍子及其配方颗粒经PCR及凝胶电泳后,可在约138 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,伪品倍蛋蚜虫虫瘿无条带。结论:建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别五倍子药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中的五倍子蚜虫源性成分,也可为其他中药配方颗粒的质量标准研究提供参考。     

紫河车饮片干浸膏粉及配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的：紫河车在我国有悠久的药用历史,《中华人民共和国药典》自2015年版起不再收录紫河车及其中药成方制剂,但市场上仍有紫河车饮片及含紫河车的产品,并存在使用猪、牛、羊等动物胎盘伪充紫河车入药的现象。建立一种适用于紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒的特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法：根据紫河车COⅠ基因序列筛选适用于紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒的稳定引物区间,并在区间内筛选获得紫河车及其混伪品的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点,设计特异性鉴别引物,优化反应体系,并对此方法进行耐受性及适用性考察。结果：当退火温度为60℃,循环数为33次时,紫河车正品饮片、干浸膏粉及配方颗粒均能扩增出约110 bp片段,其他3种伪品及阴性对照均无条带。结论：建立的特异性PCR鉴别方法可准确地鉴别紫河车及相关产品真伪。     

金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究

中药配方颗粒已失去所有形态学辨识特征,传统鉴定方法无法有效鉴定其真伪。该文使用位点特异性PCR鉴别技术,根据金银花trnL-trnF的一个SNP位点设计特异性鉴别引物,对金银花基原植物及配方颗粒进行鉴定。经过优化DNA提取方法后,药材与配方颗粒均成功提取到DNA,金银花基原植物及配方颗粒均可扩增获得约110 bp的条带,混伪品无条带。且BLAST结果比对证明PCR产物序列为金银花trnL-trnF序列。该文研究结果表明,DNA分子鉴定方法可弥补性状、显微鉴别局限性,对中药配方颗粒真实性进行快速准确的鉴定,为其生产、流通、用药安全提供科学依据和保障。     

地骨皮的多重位点特异性PCR鉴别

目的 使用多重位点特异性聚合酶链式反应（PCR）的方法，简单高效地鉴定地骨皮（Lycii Cortex）的2种基原植物枸杞（Lycium chinense）和宁夏枸杞（L. barbarum）。方法 在使用植物叶绿体基因组数据库（CGIR）获取枸杞和宁夏枸杞叶绿体基因组序列的基础上，利用IdenDSS软件筛选出两基原间特定的单核苷酸多态性（SNP）位点，并利用Primer 5.0软件设计获得特异性鉴别引物，包括鉴别枸杞的引物GQ-F/R、鉴别宁夏枸杞的引物NX-F/R。对引物浓度比、退火温度、循环次数、Taq酶进行优化，形成最适的PCR鉴别体系和条件，并对采集自不同地区的地骨皮进行适用性考察。结果 对影响PCR结果的各个条件进行考察优化后，最终确定枸杞和宁夏枸杞的引物浓度比为2∶1、退火温度为59 ℃、循环次数为30次时，来自不同产区地骨皮的2个基原枸杞和宁夏枸杞分别在183、295 bp的位置出现特异性鉴别条带。结论 通过一次PCR即可方便、快捷、高效地鉴定地骨皮的基原，为枸杞和宁夏枸杞的专属性鉴别提供新方法，同时对含有地骨皮成分的经典名方的研发提供一定的技术支撑。     

多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别

目的 建立一种同时鉴别九里香药材两基原九里香Murraya exotica和千里香M. paniculata的DNA分子鉴别方法。方法 通过比较九里香、千里香的叶绿体基因组序列差异,根据叶绿体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）变异位点分别设计九里香和千里香的特异性鉴别引物P03和P04,对影响聚合酶链式反应（PCR）结果的退火温度、循环次数、引物浓度比进行优化,建立了九里香和千里香的多重位点特异性PCR鉴别方法,并对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性考察和适用性考察。结果 在该多重位点特异性PCR鉴别方法中,当PCR反应循环数为31次,退火温度为60 ℃,九里香P03和千里香P04引物比为1∶2时,九里香可获得约330 bp的特异性条带,千里香可得到约230 bp的特异性条带,不同来源的九里香和千里香样品使用建立的多重位点特异性PCR鉴别方法均可获得一致结果。结论 该文建立一种快速、准确鉴别九里香药材基原的多重位点特异性PCR鉴别方法,可在单次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别九里香和千里香。     

鹿茸、鹿角的位点特异性PCR鉴别

目的:建立一种快速、高效、简便的鹿茸、鹿角位点特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:通过比较梅花鹿、马鹿及其混伪品的COI,Cytb基因序列差异,根据Cytb片段上的3个SNP (single nucleotide polymorphism)变异位点设计出一对鹿茸的特异性鉴别引物LR-238上游和LR-238下游,并对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶用量和及影响重复性的Taq酶种类和PCR仪型号等进行方法学考察和优化。结果:进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为56℃,循环次数为35次的条件下,鹿茸、鹿角正品均能扩增出约250 bp片段,其他9种混伪品麋鹿、白唇鹿、水鹿、坡鹿、黇鹿、骡鹿、驯鹿、驼鹿、狍及阴性对照无条带。不同来源的药用的马鹿亚种东北马鹿、塔河马鹿、天山马鹿、阿拉善马鹿、阿勒泰马鹿、新西兰马鹿,梅花鹿亚种东北梅花鹿、华南梅花鹿样品使用建立的位点特异性PCR鉴别方法均产生约250 bp特异性鉴别条带。结论:该文设计的鉴别引物具有高度的专属性,所建立的位点特异性PCR鉴别方法可用于鹿茸、鹿角的准确鉴别。     

烫骨碎补配方颗粒的提取工艺优选及其含量测定

目的:优选烫骨碎补配方颗粒的提取工艺,建立柚皮苷的含量测定方法,为有效控制该制剂的质量提供参考。方法:以柚皮苷提取量和出膏率为综合评价指标,采用正交试验考察加水量、提取时间和提取次数对烫骨碎补配方颗粒提取工艺的影响。采用HPLC测定柚皮苷含量,流动相甲醇-乙酸-水(35∶4∶65),检测波长283 nm。结果:最佳提取工艺为浸泡0.5h,加10,8倍量水提取2次,每次0.5 h;柚皮苷质量分数0.77%,出膏率12.6%。柚皮苷在0.063~1.575μg与峰面积呈良好线性关系,平均加样回收率100.70%,RSD 1.2%;暂定本品配方颗粒每1 g含柚皮苷≥5.0 mg。结论:该提取工艺和含量测定方法稳定可行,有效成分提取效率高,为烫骨碎补配方颗粒的生产和质量控制提供参考。     

蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统 关系的ITS序列分析

目的:为了阐明蚂蟥Whitmania pigra,水蛭Hirudo nipponia种间遗传分化系统关系.方法:运用TTS测序分析我国不同地区蚂蟥W.pigra、水蛭H.nipponia核糖体TTS碱基序列差异,用MEGA4.0软件中的MP法构建的分子进化树.结果:蚂蟥和水蛭平均总TTS序列长度在857.2～861.2 bp,其碱基A,T,G,C的平均分别为25.12%,28.28%,17.34%,29.29%.GC含量明显高于AT含量.通过对蚂蟥、水蛭TTS基因片段遗传特征的研究发现其种内变异很小,在14个群体中有45个位点发生转换.MP系统树将14个种群蚂蟥和水蛭分为两大类群.结论:蚂蟥和水蛭的变异类型可能为种内变异为主.同时发现,基于DNA序列的蚂蟥及水蛭的系统分类结果与分类学的分类结果不完全一致,可能是由TTS序列在进化过程中发生了少量位点的变异,如碱基之间的转换、颠换和缺失等造成的.     

蚂蟥与螺蛳耗氧率、窒息点相关性及最适投喂方式的研究

采用静水呼吸室法测定不同质量蚂蟥和螺蛳的耗氧量、耗氧率和窒息点,生物量测定法研究不同投喂方式对蚂蟥生长的影响。结果表明:25℃条件下,蚂蟥和螺蛳耗氧量与质量呈正相关(P0.05),窒息点随质量增大而增大(P0.05)。蚂蟥耗氧率与质量呈负相关,螺蛳耗氧率随质量增大呈先增大后减小趋势。投喂方式对蚂蟥终末质量、SGR,WGR和死亡率影响不显著,对进食比例影响显著(P0.05)。蚂蟥最适投喂频率为3 d投喂1次,应根据蚂蟥和螺蛳各阶段耗氧量及窒息点,结合养殖密度、水体面积以及换水频率,科学合理计算出螺蛳的投喂量。     

宽体金线蛭仿生酶解液物质基础分析

目的 对宽体金线蛭仿生酶解液进行物质基础分析。方法 采用化学定性和定量的方法,对固形物、无机盐、肽、氨基酸等物质进行含量测定,并进行核苷特征图谱及肽特征图谱研究。结果 通过对15批宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱研究,确定固形物、无机盐、肽、游离氨基酸、总氨基酸的质量浓度分别为75.5～79.7、10.7～12.7、42.6～49.4、1.9～3.1、49.4～51.6 mg·mL^–1。建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱,共标定和归属了4个特征峰;建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱,共标定6个特征峰。结论 建立了宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱的研究方法,简便快捷、重复性好,可用于对其进行质量控制。     

宽体金线蛭室内产茧、孵化及仔蛭饥饿研究

目的：建立宽体金线蛭室内网箱湿土养殖新模式,为中药材生产质量管理规范及规模化繁养殖提供参考依据。方法：以野外采捕的具有生殖环带的宽体金线蛭为试验材料,在室内采用网箱湿土法养殖,进行宽体金线蛭产茧、卵茧孵化及仔蛭饥饿试验研究。结果：亲蛭采用网箱湿土法养殖17d,其平均成活率为90％;产茧前具有生殖环带（土黄色）,产茧后生殖环带消失;亲蛭产卵茧后平均体重下降率达（29．94±0．01）％;产卵茧期间共收获卵茧79枚,平均产茧量为1．8枚／条,卯茧平均重量为（0．50±0．21）g／枚,平均长径和短径分别为（1．75±0．31）cm／枚和（1．10±0．18）cm／枚;卵茧在室温下（14—33℃）孵育34d,共孵出仔蛭865条,每枚卵茧孵出（11．4±2．0）条仔蛭,卵茧孵化率达92．57％。初孵仔蛭平均个体体重为（0．0205±0．0084）g。饥饿试验表明,在140d时,对照组存活11条水蛭,成活率仅22％,其平均个体体重为（0．1084±0．0877）g,仔蛭个体体重有随日龄的增加而增加趋势;饥饿组仔蛭在140d时全部死亡。结论：在适宜的条件下,采用网箱湿土养殖法,宽体金线蛭可在室内产茧,卵茧集中孵育及亲蛭和仔蛭分开饲养。     

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

蚂蟥酶解工艺研究

目的确定蚂蟥的最佳酶解工艺。方法选取活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)3种抗凝活性指标,以外翻肠囊实验筛选蚂蟥酶解物在肠吸收前后最佳活性测定指标。采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶(先胃蛋白酶后胰蛋白酶)对蚂蟥进行酶解,以筛选得到的最佳活性指标考察酶的种类、酶底比、酶解时间以及酶解温度对蚂蟥酶解工艺的影响。结果 TT是测定蚂蟥酶解物抗凝活性的最佳指标,采用胰蛋白酶对蚂蟥酶解可获得高活性的酶解产物,最佳的酶解条件为温度73℃,酶底比10%,酶解时间8 h。结论 TT作为抗凝指标进行酶解工艺考察,可反映整个凝血过程,结果更可靠,且该法操作简便,灵敏度高。所优选的酶解工艺简单可行,可为蚂蟥合理提取提供依据。     

一测多评法同时测定菊花配方颗粒中8个成分的含量

目的：建立一测多评法(QAMS)同时测定菊花配方颗粒中绿原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、芦丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量。方法：采用高效液相色谱法进行含量测定,色谱柱为Agilent TC-C₁₈ (250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,检测波长为348 nm,流速为1.0 mL·min^–1,柱温为30℃,进样量为10μL。以木犀草苷为内标物,采用多点校正法计算其他7个成分的相对校正因子,测定8个成分的含量,并比较与外标法测定结果的差异。结果：8个成分在一定质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率为96.7%～102.1%,RSD为1.8%～2.9%。QAMS与外标法测定7批菊花配方颗粒中8个成分含量差异无统计学意义。结论：建立的QAMS简便快速,可以更全面地控制菊花配方颗粒的质量。