应用酵母单杂交体系筛选与大鼠谷胱甘肽S—转移酶P增？…

目的 探讨谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－Ｐ）基因表达调控机制的多样性及其与化学致癌的关系,筛选与大鼠ＧＳＴ－Ｐ增强子元件ＧＰＥⅠ相互作用的调控因子。方法 采用酵母单杂交体系重申选与ＧＰＥⅠ核心序列相互作用的转录激活因子,应用ＤＮＡ序列测定及计算机分析等手段对所测的ＤＮＡ序列进行分析。结果 共获得两个阳性克隆ｐＹＧＰＥ１和ｐＹＧＰＥ２。ＤＮＡ测序分析表明：ｐＹＧＰＥ１的插入片段与大鼠原癌基因ｃ－ｊｕｎ     

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因顺式调控元件的搜寻

目的搜寻大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因（ｒａｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅＰ１，ｒＧＳＴＰ１）上游３．０ｋｂ区域内顺式调控元件。方法采用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体，以外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）、Ｓ１核酸酶对上述３．０ｋｂ片段进行删切后造成缺失，将所获得的一系列缺失质粒分别转染ＨｅＬａ细胞，测定转染细胞裂解液荧光素酶活性。结果当删切从－２．９ｋｂ进展至－２．３ｋｂ时，荧光素酶活性降低６７％（Ｐ＜０．０５），－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ区域能以不依赖于位置、方向性的方式增强基因表达强度，从－１．８ｋｂ缺失到－１．３ｋｂ时，荧光素酶活性升高４倍（Ｐ＜０．０５）。结论ｒＧＳＴＰ１基因上游在－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ及－１．８ｋｂ～－１．３ｋｂ区域内分别存在增强子元件和负调控序列。     

谷胱甘肽S-转移酶P1基因多态性与胃癌发展的相关性研究

目的分析谷胱甘肽S-转移酶（glutathione-S-transferase GSTs）P1基因多态性与胃癌发展的相关性,探讨高风险GSTP1-Val等位基因在氧自由基致胃癌中的作用。方法以血液样本、胃癌细胞和相应正常胃黏膜细胞样本为实验材料,采用放射免疫分析法（RIA）测定血浆谷胱甘肽S-转移酶P（GSTP）的含量和活性改变;多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测外周血DNA GSTP1的多态性。结果胃癌、肠上皮化生和不典型增生两种癌前病变组织中GSTP染色的阳性率分别为78.00%（39/50）、48.00%（24/50）和74.00%（37/50）,与正常胃黏膜比较差异有统计学意义（P〈0.05）;GSTP在胃癌时升高[（27.5±24.5）μg/L],明显高于正常人组[（7.1±2.3）μg/L],两组比较差异有高度统计学意义（P〈0.01）;GSTP在癌前病变组[（16.8±12.3）μg/L]高于正常人组（P〈0.01）;GSTP含量与肿瘤的分化程度呈正相关（r=0.914,P〈0.01）;高分化及中分化管状腺癌的阳性率分别为72.73%（8/11）和100.00%（21/21）,高于低分化管状腺癌（58.33%）,分化程度与GSTP表达呈正相关（r=0.732,P〈0.01）。Val 105的酶代替具有Lle 105的酶对多环芳烃二醇环氧化作用的效力高7倍,说明携带Val等位基因的个体患胃癌危险性明显高于非携带Val等位基因个体。结论 GSTP是机体损伤解毒的酶,它与肿瘤的发生、发展有关,是肿瘤早期诊断有价值的标志酶;GSTP1基因多态性与胃癌发展相关。携带GSTP1 Val等位基因的个体胃癌发病风险增高。     

应用酵母双向杂交系统筛选和鉴定P75NGFR作用的蛋白

目的：探讨Ｐ７５ＮＧＦＲ介导神经细胞凋亡的分子机制。方法;以转染了Ｐ７５ＮＧＦＲ的大鼠小脑神经细胞株Ｒ２Ｌ２为细胞模型,应用酵母双向杂交系统（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）筛选和鉴定Ｐ７５ＮＧＦＲ胞内区Ｐ７５ＩＣＤ作用的蛋白。结果：和Ｐ７５ＮＧＦＲ作用的蛋白由一个６００ｂｐ大小的ＣＤＮＡ片段编码。结论：该工作将有助于探讨Ｐ７５ＮＧＦＲ介导细胞凋亡的分子机制和信号,为勃勃系统退行性病变的病因、     

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索.方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109.毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质.结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用.结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性.     

酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质

目的：寻找体内能够与Fbxl16相互作用的蛋白质，用以揭示该蛋白的功能及其在脊髓损伤修复过程中的作用．方法：通过RT-PCR技术克隆scirrl基因编码区序列，将其克隆入pSos载体以构建质粒pSos-scirrl．把该重组质粒表达的融合蛋白hSos-Fbxl16作为诱饵蛋白，用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑eDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质，最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证．结果：成功构建了融合蛋白表达质粒pSos—scirrl之后，筛选出了14个与Fbxl16阳性相互作用的蛋白质；通过回转实验验证，确定其中两个蛋白能与Fbxl16相互作用，分别是cAMP依赖蛋白激酶α型催化亚基（protein kinase，cAMP-dependent，catalytic，alpha，Prkaca）和衣被蛋白复合物ζ亚基（coatomer protein complex，subunit zeta1，Copzl）．结论：Fbxl16和Prkaca的相互作用为解释cAMP通路与脊髓损伤的关系提供了新思路，提示Fbxl16与细胞内物质转运有关．     

酵母双杂交筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白实验研究

目的采用Clontech公司酵母双杂交系统,筛选与血管生成素样蛋白5（ANGPTL5）相互作用的蛋白。方法将ANGPTL5基因克隆到诱饵载体pGBKT7,在证实ANGPTL5蛋白不具有自激活作用的前提下,在人HeLa细胞cDNA文库中,以酵母双杂交系统筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白,并进行相互作用的验证。结果成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ANGPTL5,筛选出2种蛋白与ANGPTL5相互作用,即SNARE相关蛋白（SNAPIN）和ZW10相互作用蛋白（ZWINT）。结论运用酵母双杂交技术,从人Hela细胞cDNA文库中成功获得2个与ANGpL5相互作用的蛋白质,为研究ANGPTL5的功能提供了新的线索。     

应用酵母单杂交系统筛选CpG免疫激活序列的特异性结合蛋白

目的：寻找与CpG免疫激活序列（immunostimulatory sequence,ISS)有选择性相互作用的蛋白,以进一步探讨其分子作用机制。方法：采用酶母单杂交系统,以4重复的ISS为“锈饵”,对人骨髓细胞cDNA文库进行初步筛选,并对部分阳性克隆以电泳迁移率变动分析（EMSA）进行验证。结果：已获得4个双阳性克隆,其中两个编码功能未知的蛋白,而另外两个均属抗体轻链,分别与抗DNA抗体和抗乙肝表面抗原抗体（HBsAb)高度同源;EMSA发现HBsAb可在偏酸pH条件下（pH6.4和5．8时）特异性地与含ISS的寡核苷酸（CpG-ODN）结合。结论：HBsAb可与ISS特异性结合。     

酵母双杂交筛选与人巨细胞病毒US28相互作用的蛋白

目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒US28蛋白相互作用的宿主蛋白,可为研究US28蛋白的作用机制提供依据。方法构建p GBKT7-US28诱饵重组载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用,然后利用酵母双杂交系统筛选人脑文库中与US28相互作用的蛋白质。对获得的阳性克隆进行PCR鉴定、测序及序列比对分析,并通过酵母共转化实验再次确认蛋白的相互作用。结果 p GBKT7-US28在酵母中成功表达US28融合蛋白;酵母双杂交筛选并验证,获得了5个与US28蛋白相互作用的宿主蛋白。结论初步鉴定得到5个与US28相互作用的细胞蛋白,为探索US28蛋白的新功能以及揭示巨细胞病毒的致病机理和疾病治疗奠定基础。     

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质,以初步了解DAT1的功能.方法构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步验证.结果获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母中的结合.结论DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(Similar to Down syndrome critical region gene2,DSCR2)、钙-整合素结合蛋白(calcium and integrin binding protein,CIB)、和HSPC170(CD34 hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)结合.     

利用酵母双杂合系统筛选与hERRα1相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂合系统筛选乳腺组织中与人雌激素受体相关受体α1(Human estrogen receptor relatedreceptorα1，hERRα1)相互作用的蛋白质，特别是新的核受体辅助活化因子，以进一步研究核受体辅助活化因子在乳腺癌发生、发展中如何参与ERRl调控基因的表达。方法 以质粒pGBT9-hERrα1／LBD为“诱饵”，筛选人乳腺组织cDNA文库。结果 筛得有阳性相互作用的克隆共17个。除3种为已知核受体辅助调节因子外，其他为功能已经明确的蛋白，其中有3种与hERRα1有明显相互作用。结论核受体辅助活化因子SRc-1，RIP140，TRIP及数种已知蛋白能与孤儿核受体hERRα1在乳腺组织中相互作用。     

基于酵母双杂交技术的PRR11相互作用蛋白筛选与初步分析

目的：采用酵母双杂交技术,筛选PRR11的相互作用蛋白,为深入研究其分子行为机制奠定基础。方法：构建用于酵母双杂交筛选的PRR11诱饵质粒并检测其自激活作用,根据结果进一步构建突变体获得具有较低自激活作用的突变体。对人胎脑cDNA文库进行筛选,获得初始阳性克隆。通过LacZ报告基因检测、回转验证、阳性克隆测序及BLAST序列比对分析,排除假阳性克隆和重复克隆,确定PRR11的候选相互作用蛋白。结果：PRR11具有自激活作用,构建了一个较低自激活作用的PRR11突变体。通过酵母双杂交筛选,获得102个初始阳性克隆转化子。经LacZ报告基因检测,将阳性克隆锁定至39个。通过测序和序列比对分析,证实这39个克隆属于编码15种不同蛋白的基因。最终有RNF41等4个蛋白通过回转验证。结论：RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13是PRR11的潜在相互作用蛋白。     

以酵母双杂交系统从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列

目的应用酵母双杂交技术研究与增生性瘢痕相关新候选蛋白P311发生相互作用的蛋白.方法应用酵母双杂交系统,以人P311为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的阳性克隆.以回复性杂交试验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析.结果经过酵母双杂交共获得355个克隆,经过测序和验证,最终确认8个克隆基因.结论获得的8个基因编码的蛋白可能与P31l的作用过程有关.     

人胎盘型谷胱甘肽S-转移酶抗体的制备及其在肺癌研究中的应用

报告了人胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)抗体的制备和应用。免疫沉淀和免疫组化显示,该抗体与日本Sato教授赠送的GST-π抗体具有相同的特异性和反应性。用免疫金银法检测了40例肺癌组织和配对肺组织对GST-π抗体反应的情况,肺组织呈弱阳性反应,19例鳞癌均为阳性,腺癌和小细胞癌的阳性率分别为89%(16/18)和33%(1/3),与所赠送抗体检测结果相比,差别无统计学意义(P>0.05)。免疫吸印法(Western blot)表明肺癌组织中GST-π水平明显高于正常肺组织。GST-π是非小细胞肺癌的一种标志酶,兔抗GST-π抗体能够较精确、敏感地用于检测组织中的酶蛋白。     

延胡索酸二甲酯对大鼠醌还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶的诱导作用

据《中华预防医学杂志》1999年11月33卷第6期报道 北京医科大学王立新等为了探讨延胡索酸二甲酯(DMF)对大鼠主要脏器醌还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶的诱导作用和意义,在雄性Wistar大鼠饮食中补充0.2％DMF,于6、24、72小时、1和2周后取血并处死动物,用酶动力学法测定大鼠腺胃、肝、肺、肾     

大肠癌LoVo/Adr细胞多药耐药性与谷胱甘肽S-转移酶关系的研究

目的 阿霉素诱导大肠癌LoVo细胞产生耐药性的同时观察谷胱甘肽S-转移酶活性和含量的变化，探讨其与耐药的关系。方法 采用阿霉素浓度递增法诱导耐药；采用MTT、法检测耐药性；GST-π检测采用免疫组化染色；谷胱甘肽S-转移酶活性测定采用1氯-2，4-二硝基苯法。结果 建立了人大肠癌多药耐药LoVo／Adr细胞株；LoVo／Adr细胞GST-Ⅱ蛋白表达显著高于LoVo细胞；LoVo／Adr细胞与LoVo细胞GST活性相比，没有显著差异。结论 耐药的LoVo／Adr细胞株其耐药机制与GST有关。     

用酵母双杂交体系筛选与FMRP相作用蛋白的cDNA

目的 采用平双杂交体系寻找与脆性Ｘ智力低下蛋白相互作用的蛋白,探讨ＦＭＲＰ的生物医学功能。方法以编码ＦＭＲＰＰｐｒｏ３２７－Ｔｈｒ５１８肽段的ＣＤＮＡ序列与ＰＢＴＭ１１６质粒ＤＮＡ结合结构域重组作为“钓饵”,从小鼠胎ＣＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ＣＤＮＡ。结果 筛选出１３个与ＦＭＲＰＰｒｏ３２７Ｔｈｒ５１８肽段特异性地相互作用的克隆,其中１２个为小鼠泛素转运酶９（ＵＢＣ９）,１个是在ＧｅｎＢ