微缺氧对人结肠癌细胞HT-29骨桥蛋白及核转录因子表达及其侵袭能力的影响

目的探讨微缺氧与人结肠癌细胞HT-29侵袭能力的关系及其机制。方法建立微缺氧模型，噻唑蓝（MTT）比色试验测定HT-29细胞的异质性黏附能力，transwell侵袭试验判定其侵袭游走能力，内皮细胞小管形成实验检测促进新生血管形成的能力；将HT-29细胞微缺氧处理0、6、12、24、48h，明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2／9活性变化，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测骨桥蛋白（OPN）的mRNA和蛋白表达，Westernblot检测胞核内核转录因子（NF-KB／p65）蛋白表达。结果微缺氧诱导24h后，HT-29细胞的异质性黏附能力、侵袭游走能力显著增加，明显促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成管状结构。微缺氧下6h，MMP-2／9活性无明显变化，尔后随着微缺氧时间的延长，其活性逐渐显著上调，24h达顶峰，48与24h差异无统计学意义（P〉0．05）。HT．29细胞在微缺氧的诱导下，其OPN的mRNA和蛋白以及胞核内NF-KB／p65蛋白的表达趋势与MMP-2／9活性变化趋势类同。结论微缺氧能诱导HT-29细胞异质性黏附能力、侵袭游走能力显著增加，MMP-2／9活性上调，促进新生血管形成而促使其向恶性表型转化。OPN-NF-KB可能是微缺氧下继HIF-I之外的另一重要调节途径，该途径与微缺氧诱导的恶性表型密切相关。     

反义c-myc寡核苷酸对人肝癌细胞恶性表型的逆转作用

我们采用反义ｃ ｍｙｃ核酸技术观察反义ｃ ｍｙｃ寡核苷酸 (ＯＤＮ)对人肝癌细胞ＳＭＭＣ 772 1生长的抑制作用 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.寡核苷酸的合成及修饰 :正义、错配及反义ｃ ｍｙｃＯＤＮ (均为 15 ｍｅｒ)的合成和磷酸基硫代化修饰均由上海生物工程公司完成。设计的序列为 :5’ ＡＴＧＣ ＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴ 3’正义寡核苷酸序列 ;5’ ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ 3’反义寡核苷酸序列 ;5’ ＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡ 3’错配链寡核苷酸序列。2 .人肝癌细胞ＳＭＭＣ 772 1培养和基因转染 :人肝癌细胞Ｓ…     

BCL-2硫代反义寡核苷酸增强结肠癌细胞对顺铂的敏感性

目的 了解BCL-2(死亡抑制基因)硫代反义寡核苷酸增强结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。方法 应用BCL-2硫代反义寡核苷酸(BCL-2 SON)和顺铂(cis-platinum)共同处理结肠癌细胞系SW620,通过免疫组化法观察其BCL-2蛋白表达的变化,并通过TUNEL染色和流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果 BCL-2 SON处理过的SW620细胞呈BCL-2免疫组化染色阴性,而对照组则为阳性。同时应用BCL-2 SON和10ug/ml顺铂共同处理的SW620细胞凋亡指数为64.7±8.4％,显著高于单纯顺铂处理组的23.6±6.3％(n=5,P<0.01)以及单纯BCL-2SON处理组的27.5±5.1(n=5,P<0.01)。而未经处理的对照组SW620细胞凋亡指数则为8.5±1.2％,显著低于后两组(n=5,P<0.05)。结论BCL-2SON可通过抑制结肠癌细胞BCL-2蛋白的表达,从而增强其对化疗药物的敏感性。     

Stat3反义寡核苷酸联合化疗调控结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

目的　探讨Stat3反义寡核苷酸 (Stat3AS ON)联合 5 氟尿嘧啶 (5 FU )治疗结肠癌的作用机制。方法　应用Stat3AS ON与 5 FU处理结肠癌细胞HCT116,Westernblot检测Stat3、p Stat3、CyclinD1与bcl xL表达 ,MTT法检测细胞增殖状态 ,流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果　Stat3AS ON与 5 FU作用于HCT116细胞 72h后 ,G1期细胞比率由 63 .7%上升至 82 .2 % ,S期细胞比率分别由 17.6% ,下降至 9.9% ,凋亡细胞百分比由 6.1%增加至 3 2 .0 %。Stat3AS ON与 5 FU可以抑制结肠癌细胞增殖 ,促进结肠癌细胞凋亡 ,联合应用Stat3AS ON与 5 FU可以起协同作用 ,明显抑制结肠癌细胞Stat3信号转导通路活化。结论　选择性阻断细胞内信号转导通路可能为治疗结肠癌提供新途径     

CD44反义寡核苷酸抑制胃癌细胞粘附侵袭的研究

我们将CD44特异反义寡核苷酸转染高转移人胃癌细胞系SGC790 1,观察其对CD44基因表达及癌细胞粘附侵袭能力的影响。一、材料与方法1.材料 :人胃癌细胞系SGC790 1分3组 :Ⅰ对照组 ,未加任何处理因素 ;Ⅱ转染反义寡核苷酸 (asODN )组 ;Ⅲ转染随机序列寡核苷酸 (rODN )组。各组实验重复 4次。DMEM培养基 (Gibico公司 )、小牛血清 (TBD生物技术发展中心 )、Matrigel胶 (Sigma公司 )、抗CD44单抗 (福州迈新公司 )、FITC 羊抗鼠IgG(北京中山生物技术有限公司 )、硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列及CD44引物序列 (上海生工公司 )、脂质体 …     

β1整合素反义寡核苷酸对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响

目的观察β1整合素反义寡核苷酸（ASODN）对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响。方法采用脂质体将不同浓度β1整合素ASODN转染到人胰腺癌BXPC-3细胞中，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western印迹法和Transwell侵袭室方法分别检测细胞β1整合素mRNA、蛋白表达水平及体外侵袭能力。结果与对照组相比，32～128mg／LASODN转染后可抑制β1整合素mRNA和蛋白的表达（P〈0．05），64mg／LASODN转染使BXPC-3细胞体外侵袭力明显下降（P〈0．05）。结论靶向β1整合素的ASODN可有效抑制其在人胰腺癌BXPC-3细胞中的表达。并降低癌细胞体外侵袭力。     

反义Survivin对人结肠癌细胞凋亡及耐药性的影响

目的 观察Survivin ASODN联合长春新碱（VCR）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）对人结肠癌细胞系HT-29凋亡的影响。方法 设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸（ASODN）。HT-29细胞分成6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、100、200、300nmol／L反义链转染组。以阳离子脂质体为载体转染至HT-29细胞内，用Westernblot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；MTT法检测VCR、5-Fu对转染前后细胞的生长抑制情况。结果各浓度ASODN转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少，而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化。各ASODN转染组VCR、5-Fu对肿瘤细胞生长抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），且300nmol／L转染组明显高于100和200nmol／L组（P〈0．05）。ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05），以300nmol／L转染组加VCR作用后凋亡指数最高（P〈0．01）。结论Survivin ASODN转染人结肠癌细胞能下调Survivin蛋白的表达，诱导结肠癌细胞凋亡，抑制细胞增值，增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的 …

目的 探讨端粒酶反义核酸对肾癌细胞端粒酶活性和体外增殖的影响。方法 以端粒酶ＲＮＡ模板区为靶点,序列为ＴＡＧＧＧＴＡＧＡＣＡＡ的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）与肾癌细胞株ＲＣＺ细胞共同孵育,计１～２８天细胞数,ＭＴＴ比色法测细胞生长抑制率,ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法检测端粒酶活性。结果 ＡＳＯＮ实验组与随机引物及空白对照组比较,端粒酶活性明显降低（Ｐ〈０．００１）,细胞增殖数目显著减少（Ｐ〈０．     

125I偶联Ki-67反义核酸对人肾癌细胞生长及凋亡的调控作用

目的　探讨12 5I偶联Ki 67基因反义寡核苷酸 (12 5I ASODN)对人肾癌细胞生长及凋亡的调控作用。方法　采用氯胺 T法将 10 μmol/L浓度的Ki 67反义寡核苷酸 (ASODN)与12 5I偶联 ,12 5I ASODN放射浓度为 2 .5 9MBq/L ,脂质体包装后转导肾癌 786 0细胞系。采用免疫组织化学、Western印迹技术检测Ki 67表达 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,免疫组织化学脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记 (TUNEL)法检测细胞凋亡。结果　12 5I ASODN处理组肾癌细胞Ki 67表达阳性率 (2 1.5± 1.2 ) %降低 ,Ki 67蛋白 (4 9.9± 4.5 ) %降低 ,与ASODN处理组(2 9.9± 0 .4) %、(82 .1± 1.9) %比较差异有非常显著性 (P均 <0 .0 1)。细胞增殖抑制率12 5I A SODN处理组 (4 7.9± 3 .6) %与ASODN处理组 (2 1.8± 2 .5 ) %比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。凋亡细胞阳性率12 5I ASODN处理组 (2 8.9± 1.3 ) %与ASODN处理组 (15 .7± 0 .5 ) %比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　12 5I ASODN较之ASODN具有更强的抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用。     

Galectin-9基因不同亚型对结肠癌LoVo细胞株体外黏附侵袭能力的影响

目的 构建galeetin-9基因不同亚型的真核表达载体,观察galectin-9对结肠癌LoVo细胞体外黏附侵袭能力的影响.方法 构建galectin-9基因不同亚型的真核表达载体后,用脂质体法转染结肠癌LoVo细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证转染效果.LoVo细胞分别在转染galectin-9、转染galectin-9+抗体(5 mg/L)和转染galectin-9+β-L糖(30 mmol/L)条件下进行体外细胞-基质黏附实验和体外细胞侵袭实验.结果 测序结果证实载体上插入的galectin-9三种剪接体碱基序列正确,同时载体成功转染LoVo细胞.体外细胞-基质黏附实验中,转染空载体,转染galectin-9L,galectin-9M和galectin-9S组平均吸光度分别为:0.74±0.04、1.14±0.12、1.12±0.10和1.15±0.13,表明galectin-9促进LoVo细胞黏附于细胞外基质(P＜0.05).galectin-9抗体和β-乳糖可抑制该作用,但转染galectin-9L和galectin-9S LoVo细胞的黏附作用受β-乳糖抑制更明显(P＜0.05).体外侵袭实验未发现galectin-9对LoVo细胞侵袭力有影响.结论 galectin-9促进LoVo细胞与细胞外基质的黏附,这可能与结肠癌侵袭转移相关,但其三种亚型发挥作用的机制不全相同.     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用

目的研究生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞系HS746T的抑制作用。方法应用SurvivinASODN转染胃癌细胞,设空白、脂质体和正义链对照组,100、200和400nmol/L反义链组。电镜下观察细胞超微结构,流质细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Westernblot法检测转染后2～48h细胞凋亡指数(AI),生长抑制率(IR),SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果转染后反义链组均能够下调SurvivinmRNA含量和蛋白表达,凋亡细胞增多。转染后24h100、200和400nmol/L反义链组AI为14.8%、19.4%及53.8%;IR(%)为45.98±2.99、50.96±3.38、72.79±2.48,反义链组高于其他对照组。结论Survivin反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞增殖。     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

小檗碱对结肠癌细胞HT-29增殖、凋亡及细胞膜钾通道的作用

目的 观察小檗碱(Berberine,以下简称"Ber")对结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡的作用并探讨其离子通道机制.方法 Ber 0.1～30.0μmol/L处理HT-29细胞.氮蓝四唑盐法检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡率,膜片钳检测延迟整流钾通道[IK(V)].结果 0.1～30.0μmoL/L Ber均可抑制HT-29细胞增殖(P<0.05),其抑癌率与作用时间及浓度相关;HT-29细胞经Ber处理24 h后,凋亡率明显增高(P<0.05),0.1、0.3、3.0、30.0μmoL/L Ber组凋亡率分别为(7.6±1.8)%、(9.8±2.1)%、(22.3±4.2)%、(40.6±4.5)%,对照组凋亡率为(2.4±1.1)%;0.3、3.0、30.0μmoL/L的Ber能浓度依赖性抑制结肠癌细胞IK(V)(P<0.01),阶跃刺激为+80 mV时,对照组、0.3、3.0、30.0μmol/L Bet组IK(V)分别为(488±42)、(376±22)、(296±25)、(225±34)pA,0.3、3.0、30.0μmol/L Ber处理组IK(V)分别为对照组的(77.16±5.41)%、(61.35±6.09)%、(45.87±7.62)%.结论 Ber具有抑制结肠癌细胞HT-29增殖并诱导其凋亡的作用,此作用可能与Ber抑制肿瘤细胞细胞膜钾离子通道开放有关.     

FasL、抗DR5单克隆抗体对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及其机制

目的 探讨FasL、抗DR5单克隆抗体(Anti-DR5 mAb)对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、噻唑蓝(MTT)比色法、DNA倍体分析,Western blot等.结果 HT29细胞表面Fas mRNA的表达低于DIL5 mRNA的表达.50 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的杀伤率分别为(25.49±0.90)%和(48.90±3.15)%,这种作用呈剂量依赖性.流式细胞术分析细胞周期和凋亡实验表明FasL和Anti-DR5 mAb能够抑制HT29细胞的生长,并且诱导它的凋亡.25 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的凋亡指数分别为(13.8±1.5)%和(22.6±1.1)%.FasL和Anti-DR5 mAb作用HT29细胞后,Caspase-3蛋白表达上升,bcl-2蛋白表达水平下降.结论 FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度的诱导结肠癌细胞株HT29凋亡,其机制与其受体和Caspase-3、bcl-2的表达有关.     

反义 miR-224在结肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖的影响

目的探讨微小 RNA(miRNA)miR-224在结肠癌组织中的表达,以及对体外癌细胞增殖和凋亡的影响。方法收集2011年2月至2014年3月行手术治疗的134例结肠癌和癌旁组织标本,利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测标本中 miR-224表达情况;对人结肠癌细胞 SW480进行 miR-224反义寡核苷酸转染并培养,利用克隆形成实验和流式细胞仪检测 miR-224反义寡核苷酸对 SW480细胞增殖和凋亡的影响,利用 Real-time PCR 和 Western blot 法对不同转染组细胞中 Bcl-2表达情况进行检测。结果miR-224在结肠癌组织中相对表达水平显著高于癌旁组织(P <0.05);反义 miR-224组人结肠癌 SW480细胞克隆形成率显著低于对照组,而细胞凋亡指数则高于对照组,差异均具有统计学意义(P <0.05);反义 miR-224组细胞 Bcl-2相对表达量和蛋白相对表达量均低于对照组(P <0.05)。结论miR-224在结肠癌组织中呈高表达,减少 miR-224表达可抑制结肠癌细胞增殖,并加速细胞凋亡,有可能成为结肠癌早期发现及基因治疗的新靶位。