慢性压迫性脊髓损伤细胞凋亡的实验研究

目的：观察慢性压迫性脊髓损伤的细胞凋亡现象,方法：45只2个月龄Wistar大鼠,置入后路渐进压迫装置,根据脊髓压迫程度分为轻,中,重3组,应用Feulgen染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素化dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术,观察不同和蔼慢必压迫性脊髓损伤后各种细胞凋亡的特点,结果：不同程度损伤直接受压段中,中度损伤的凋亡现象是了为显著,与轻度,重度损伤的凋亡率比较,差异有显才性产意义（P＜0．01）,凋亡细胞主要分布在白质纵向传导束上髓的区域,主要为少突胶质细胞,神经元存在少量凋亡现象,分布在III－IX板层,主要在后角,结论：细胞凋亡是慢性脊髓损继发病理变化的重要级成部分,神经元和胶质细胞凋亡是损伤后细胞死亡的主要原因之一,少突胶质细胞凋亡可能是白质脱髓鞘的主要原因。     

脊髓损伤的细胞凋亡及其调控

脊髓损伤后 ,除神经细胞坏死外 ,还存在细胞凋亡 ,并在继发性脊髓损伤中起重要作用。笔者对近年来脊髓损伤后细胞凋亡及其分子调控机制作如下综述。一、细胞凋亡在继发性脊髓损伤中起重要作用脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤 ,而神经细胞的凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分。在不同脊髓损伤模型中的许多研究证实 ,继发性脊髓损伤广泛存在着神经细胞凋亡[1～ 1 0 ] 。Ｌｉ等[1 ,4] 观察大鼠脊髓压迫损伤后 4～ 9ｄ ,在损伤部位 (Ｔ8,9)及相邻节段 (Ｔ7、Ｔ1 0 )白质有大量的胶质细胞凋亡 ,细胞主要是少突胶质细胞 ,而灰质的神经元不表…     

外源性三磷酸腺苷对大鼠慢性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白表达的影响

三磷酸腺苷 (ＡＴＰ)作为中枢神经系统的神经递质和神经调质 ,对神经冲动的传导有重要作用。近年来的研究表明 ,ＡＴＰ与感觉神经传导、突触发育及神经细胞营养再生有密切联系[1 ,2 ] 。笔者通过生物行为学观察及免疫组化检测 ,研究外源性ＡＴＰ对慢性压迫性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白 (ＧＦＡＰ)的表达及对神经功能恢复的影响。一、材料与方法1.动物分组 :将雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (购于兰州医学院动物室 ) 70只 ,体重 30 0～35 0ｇ ,随机分成Ａ组 (脊髓压迫 +ＡＴＰ处理组 ) 35只和Ｂ组 (脊髓压迫 +等渗盐水对照组 ) 35只 ,分别于伤后 1,4…     

脊髓损伤后星型胶质细胞活化与线粒体融合蛋白2表达变化

目的探索脊髓损伤后星型胶质细胞(AS)活化与线粒体融合蛋白2(Mfn2)的表达规律及其意义,为脊髓损伤修复寻求合适的干预靶点及时机。方法建立成年SD大鼠脊髓损伤(SCI)模型,运用免疫荧光和Western Blotting方法,检测Mfn2及AS活化相关蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化。清洁级成年雄性SD大鼠48只,随机分为两组:假手术组(sham组,n=24),脊髓损伤组(SCI组,n=24),SCI组采用Allen’s法建立大鼠胸段脊髓损伤模型,sham组只行椎板切除术,分别于术后第1天、第3天、第7天、第14天4个时间点分批处死大鼠,取大鼠胸段脊髓组织,行组织免疫荧光染色观察脊髓形态变化,Western Blotting检测各个时间点Mfn2与GFAP的表达变化。结果脊髓损伤后,大鼠胸段脊髓灰质两背角之间会形成结构紊乱、边界不清的损伤灶;Western Blotting及免疫荧光结果显示脊髓损伤后,大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表达从第1天开始下降,与sham组相比,脊髓损伤组胸段脊髓Mfn2表达整体呈下降趋势,术后第3天开始明显下降,差异有统计学意义(P0.05);而GFAP表达随时间延长则逐渐增加,术后第3天开始差异有统计学意义(P0.05)。结论脊髓损伤后,AS的特异性标志物GFAP表达整体呈上升趋势,提示此时AS出现大量增殖;与此相反,Mfn2(增殖抑制基因)表达产物则明显减少。     

大鼠脊髓急性损伤后神经细胞的凋亡

目的 研究脊髓急性损伤后神经细胞的凋亡及其分布特点。方法 44只大鼠分为对照组（4只）和损伤组（40只）。损伤组脊髓（T8．9）经中度压迫致伤后,分别在伤后30min、2,4,8,24,48,72h和7,14,21d处死取材（每时相点鼠数＝4只）。应用HE、尼氏染色及凋亡细胞原位末端标记法对脊髓组织进行细胞检测。结果 伤后4h,损伤段及邻近段可见末端标记阳性神经细胞;伤后8h,损伤段灰质中阳性细胞数达高峰;伤后24h,白质中阳性胶质细胞数达高峰;伤后72h,相邻节段阳性细胞数达高峰。阳性细胞以白质中胶质细胞为主,主要分布于相邻手段。结论 脊髓损伤后神经细胞凋亡是继发损伤期的重要病理变化。     

胶质细胞源性神经营养因子在大鼠生后腰段脊髓中分布的实验研究

为探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠脊髓运动神经元的作用,采用免疫组织化学方法,观察GDNF在大鼠生后1、3、7、10、14和28天腰段脊髓中的分布.结果发现,在生后1、7和28天脊髓灰质前角运动神经元有强阳性染色,生后3天脊髓灰质前角运动神经元呈弱阳性染色,生后1、3、7和28天脊髓灰质后角神经元和少量胶质细胞也呈阳性反应.此外,在各组大鼠腰段脊髓后根内的胶质细胞亦可见GDNF免疫阳性反应.提示GDNF可能对脊髓运动神经元的发育、存活以及功能的正常发挥起重要作用.     

人神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响

目的:探讨人神经干细胞(hNSCs)移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响及可能机制。方法:取2～3个月流产胎儿海马区组织,体外培养神经干细胞;采用通用型脊髓打击器将24只成年SD大鼠制成脊髓损伤模型,伤后第8天随机分为移植组和对照组,于损伤中心分别注入CM-DiI标记的hNSCs悬液和DMEM/F12培养液。分别于hNSCs移植后当天及1、2、3、4、6、8周采用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)行为功能评定量表评估大鼠后肢运动功能恢复情况。移植后第4、8周取损伤部位脊髓,行病理切片,免疫组化方法观察移植细胞的存活和迁移,并检测损伤脊髓处胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核心抗原(NeuN)、2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、神经巢蛋白(Nestin)等抗原的表达。结果:移植组后肢运动功能评分随时间延长而逐渐升高,移植1周时后肢运动功能有所改善,与对照组无明显差异(6.4±0.99 vs 6.0±0.93,P>0.05);移植4周时后肢运动功能比1周时有明显恢复,BBB评分明显高于对照组(9.7±1.04 vs 7.4±0.95,P<0.05);移植的hNSCs可在损伤脊髓处长时间存活(至少8周),并分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。结论:人神经干细胞可在损伤脊髓处向神经元和神经胶质细胞分化,并能促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的部分恢复。     

大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶羧基末端PDZ结合配体mRNA的表达

目的 探讨大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶（nNOS）羧基末端PDZ结合配体（carboxy-terminal PDZ ligand of nNOS，CAPON）mRNA的表达变化及其意义。方法采用脊髓横断模型，用实时荧光定量聚合酶链式反应（realtime-PCR）及原位杂交与免疫荧光技术结合的方法检测正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点损伤段脊髓组织中CAPONmRNA的表达，采用cresylviolet染色计数脊髓组织内存活神经元。结果 CAPON mRNA在对照组大鼠脊髓内呈低水平表达于前角神经元，脊髓损伤后表达于灰质各部分神经元及白质。在损伤早期2h表达开始升高，于8h达到高峰，随后1d有下降趋势，3d时稍有上升，损伤后14d恢复至正常水平。而nNOSmRNA在损伤后2h迅速上调，于8h达高峰，随即下降至正常水平。在此过程中，有神经元凋亡现象的发生。损伤后2h存活神经元的数量即减少，随后稍有增多，但仍少于对照组，3d后存活神经元再度减少，持续至14d。结论 大鼠脊髓损伤后CAPONmRNA表达发生变化，提示CAPON可能通过调节nNOS的活性及亚细胞定位而影响神经元的凋亡，在脊髓损伤病理过程中发挥积极的调节作用。     

少突胶质前体细胞移植对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响

目的 研究少突胶质前体细胞移植对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响.方法 采用Allen's打击法制作大鼠脊髓损伤(T10)模型.96只SD大鼠随机分为移植组、对照组、单纯损伤组及假手术组,每组24只.脊髓损伤后第7天时移植组进行少突胶质前体细胞移植治疗,对照组给予等量生理盐水,单纯损伤组未予任何治疗.通过运动功能评分及运动诱发电位、体感诱发电位检测评价少突胶质前体细胞移植对神经功能恢复的影响.结果 脊髓损伤后大鼠脊神经功能明显障碍,运动功能评分、运动诱发电位及体感诱发电位检测结果明显低于假手术组.随伤后时间延长,脊髓损伤大鼠神经功能均有不同程度的恢复,但运动功能评分、运动诱发电位及体感诱发电位检测结果显示,少突胶质前体细胞移植治疗组大鼠的神经功能恢复情况明显优于对照组.结论 少突胶质前体细胞移植治疗能够促进大鼠脊髓损伤神经功能的恢复.     

慢性压迫性脊髓损伤后骨骼肌退变与再生的实验研究

目的：观察慢性压迫性脊髓损伤后骨骼肌形态学改变及其成肌细胞的增殖动力学变化。方法：50只Wistar雌性大鼠，随机分为正常组（10只）、假手术组（10只）和慢性压迫组（30只）。慢性压迫组置入平头塑料螺钉对大鼠脊髓进行后路渐进性压迫，于2个月后分别压迫至20％（10只）、40％（10只）、60％（10只）左右。处死大鼠后取腓肠肌，分别做HE染色和制成细胞悬液备用。用图像分析仪测定肌细胞直径及截面积，用流式细胞仪对成肌细胞的细胞周期进行分析。结果：各压迫组的大鼠腓肠肌细胞萎缩、退变，其直径变细及截面积变小，随压迫程度的加重而越发明显（P＜0．05）；压迫组较正常组成肌细胞S期细胞增多，G2／M期细胞减少（P＜0．05）。结论：脊髓压迫性损伤可引起靶器官肌肉的退变，其退变的程度与脊髓受压程度呈正相关。虽然同时存在骨骼肌的增殖反应，但完整的细胞分裂过程少见，这可能是慢性压迫性脊髓损伤后影响功能恢复的原因之一。     

静脉移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤

目的 研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bone martow stromal cells,BMSCs)对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响.方法 对10只同种异体SD大鼠的BMSCs进行体外分离、培养、扩增、纯化后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)进行标记;重物打击致瘫痪造模法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型,制模后7 d完全随机分为A、B、C三组:A组22只,作为BMSCs移植组,经鼠尾静脉注射2×106/ml的BMSCs细胞悬液1 ml;B组22只,作为对照组,注射1 ml培养液;C组22只,作为空白手术对照组.注射后2,3,6周,免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化并计数,观察损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)和巢蛋白的表达,注射后1,2,3,4,5,6周Basso-Beattie-Bresnaban(BBB)评分评估各组后肢运动功能.结果 移植后2,3,6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内.计数发现,移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,3周占4.4%,6周占2.9%;移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达胶质纤维酸性蛋白(glial fribrillary acidic protein,GAFP),约5.4%表达神经元特异性核蛋白(neuronal nuclear antigen,NeuN);移植后2,3,6周,A组GAP-43、NF200、巢蛋白的表达明显高于B、C组(P<0.05);移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时相点明显高于B、C组(P<0.05).结论 通过静脉注射的BMSCs能向脊髓损伤灶内迁徙、存活,表现出对损伤灶的趋化性,并向神经元和星形胶质细胞分化,上调GAP-43、NF200和巢蛋白的表达,改善神经功能,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗.     

大鼠脊髓缺血损伤后神经微丝及胶质纤维酸性蛋白的改变

目的神经微丝（ＮＦ）和胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）分别为神经细胞和胶质细胞特异的中间丝蛋白。着重探讨大鼠脊髓缺血损伤后ＮＦ和ＧＦＡＰ的改变及其可能的病理意义。方法利用ＮＦ和ＧＦＡＰ的单抗，借助于免疫组化、图像分析等手段，对大鼠腹主动脉再灌流缺血模型损伤脊髓神经细胞ＮＦ６８染色强度及胶质细胞数进行定性定量研究。结果伤后１天，ＮＦ的变化不明显；伤后３天，ＮＦ染色明显降低；７天达最低水平，并持续至２１天；２８天基本恢复至伤前。而胶质细胞数与正常相比，伤后１，３，７天无明显变化；至伤后１４天明显增加，并随时间而增加；至２８天达高峰。结论脊髓损伤后ＮＦ的降低与创伤性脑损伤中ＮＦ的变化相似，提示亦具有扩散性轴突损伤的存在。而胶质细胞的增生可能参与脊髓损伤的修复过程。     

胚胎脊髓移植对大鼠损伤脊髓胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 研究大鼠脊髓损伤后胚胎脊髓（ＦＳＣ）移植是否能够影响胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）的表达和伤后大鼠后肢功能的恢复情况。方法 将６０只大鼠分为脊髓半脊髓半切洞损伤＿胚胎脊髓移植组（Ａ组）和单纯脊髓半切洞损伤组（Ｂ组）。伤后１,３,,７,１４,２８天,应用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况,应用原位杂我和免疫细胞化学方法观察ＧＦＡＰ的表达,并采用计算机图像分析技术,进行定量分析。结果 大鼠脊髓     

NF-κB配体受体激动因子在脊髓损伤后骨髓间充质干细胞移植中的作用

目的探讨NF-κB配体受体激动因子(receptor activator of NF-kappa B ligand,RANKL)在脊髓损伤后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植中对神经功能恢复的影响。方法Wistar大鼠60只,体重250～350 g,雌雄不限,随机分为3组:(1)hBMSCs组,脊髓半横切后行hBMSCs移植;(2)RANKL hBMSCs组,脊髓半横切后hBMSCs和RANKL协同移植;(3)PBS组,脊髓半横切,移植物以PBS代替。移植后1,7,14,21,28 d采用行为学指标观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫组化和免疫荧光技术检测移植的BrdU标记hBMSCs在宿主脊髓内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性核蛋白(NeuN)的表达情况。结果大鼠脊髓半横切损伤后,hBMSCs组和RANKL hBMSCs组均较PBS对照组有明显的神经功能恢复;而移植7,14 d时,RANKL hBMSCs组动物较hBMSCs组神经功能恢复明显。RANKL hBMSCs组中hBMSCs-Ne- uN和hBMSCs-GFAP双标阳性率高于hBMSCs组。结论RANKL和hBMSCs协同移植可提高脊髓损伤后神经病学预后,提高hBMSCs在宿主体内向神经细胞的分化。     

脑源性神经营养因子对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响

目的 研究脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响.方法 脂质体介导BDNF表达质粒转染293T细胞,ELISA法确定BDNF高峰表达时相,收集高表达时相阶段细胞上清液.建立SD大鼠液压脑创伤模型,分为A组(干细胞移植组)和B组(干细胞移植+BDNF组),两组同时给予亚低温治疗(33℃)5 d.对第4天和第8大(复温后第3天)脑组织标本行增殖细胞核抗原(PCNA)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学及原位细胞凋亡检测,实验动物予以神经功能缺陷评分.结果 ELISA结果显示细胞转染48～60 h后BDNF持续高表达.亚低温处理第4天两组PCNA、巢蛋白均高表达,NSE及GFAP无或极低表达,细胞凋亡少见,但B组较A组更少(P＜0.05).复温后第3天两组PCNA、巢蛋白均表达下降,NSE及GFAP表达升高,但B组较A组NSE阳性率更高,细胞凋亡更少(P＜0.05).B组获得最佳动物神经功能评分.结论 BDNF可增加低温环境下的干细胞存活率,并诱导干细胞向神经元分化.

Abstract：

Objective To study the effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on the environmental nutrition and neural differentiation of the transplanted stem cells under hypothermia.Methods The BDNF gene mediated by liposome was transfected into 293T cell line, and ELISA assay was applied to find the peak time of BDNF expression. When BDNF was highly expressed, the supernatant was collected for establishment of SD rat models of brain injury. The rats were divided into Group A (stem cell transplantation group) and Group B (stem cell transplantation and BDNF group). Rats in both groups were under hypothermia treatment for five days. Four and eight days later ( three days from rewarming), rat brain tissues were obtained to detect the expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), nestin, neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunohistochemical method and to detect the apoptosis by in situ hybridization. Finally, the nerve function scores were obtained for evaluation of the nerve function. Results The ELISA showed that the high level of BDNF expression was at 48 to 60 hours after gene transfection. PCNA and nestin were highly expressed, while NES and GFAP showed nil or low level of expression in both groups at the fourth day after hypothermia, with little apoptotic cells especially in the Group B (P ＜0.05). The expressions of PCNA and nestin were decreased, but the expressions of NSE and GFAP were increased at the third day after rewarming. The positive rate of NSE expression in the Group B was much higher and the apoptotic cells were much less compared with the Group A ( P ＜ 0. 05 ). A better nerve score was obtained in the Group B. Conclusion BDNF can enhance the survival rate of the transplanted stem cells and induce their differentiation into neurons under hypothermia.     

壳聚糖复合絮凝剂选择性絮凝双黄连水提取液的工艺研究

摘 要：目的 优化壳聚糖复合絮凝剂用于双黄连水提取液选择性絮凝的最佳工艺条件。方法 以绿原酸和黄芩苷保留率、鞣质脱除率为考察指标,分别考察复合絮凝剂制备工艺、絮凝剂用量、絮凝时间以及壳聚糖性能指标对絮凝效果的影响,优化选择性絮凝工艺条件。结果 双黄连水提取液絮凝的优化工艺条件：膨润土经 450 ℃灼烧 4 h 改性后负载壳聚糖制备复合絮凝剂,絮凝剂用量 60 g/L,絮凝时间 24 h,所用壳聚糖最佳性能指标：脱乙酰度 95%、黏度 60 cps。结论 经高温改性的膨润土负载壳聚糖所制备的复合絮凝剂具有良好的选择性絮凝性能,絮凝效果显著优于《中国药典》2010 年版方法。     

pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤的修复作用

为观察pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞（SC）移植对脊髓损伤的修复作用，采用切割法制备脊髓半模断损伤模型（T8平面）。实验动物随机植入pSVPoMcat微基因修饰的SC（A组）、SC组（B组）和损伤对照组（C组），每组40只。术后应用联合行为记分（CBS）和皮层体感诱发电位（CSEP）动态观察大鼠功能恢复情况，应用原位杂交和免疫细胞化学方法观察胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。术后3月行MRI观察，并用免疫组化对神经轴突进行神经中丝（NF）染色。结果显示，A组能抑制大学损伤后的GFAP表达；MRI发现，A组大鼠脊髓损伤（SCI）区脊髓信号已基本恢复正常，B组未恢复正常，而C组SCI有软化灶形成。与NF染色发现一致。A、B两组潜伏时波幅呈恢复的趋势，与A组接近正常，与CBS结果一致。提示，pSVPoMcat微基因修饰SC移植能抑制SCI后GFAP的表达，促进神经轴突的生长并对神经功能恢复有明显的促进作用。     

大鼠脊髓占位损伤后细胞凋亡在不同脊髓平面、不同时间的变化及其意义

目的 探讨脊髓占位损伤后不同观察时间、损伤中心两端不同平面神经细胞凋亡的变化。方法 采用脊髓占位损伤模型，在伤后6，24，48，72h、5，7d6个时相点观察损伤中心两侧1．5，3．5，5．5，7．5mm脊髓平面的细胞凋亡情况。结果 脊髓损伤后继发性改变可影响到损伤中心头侧7．5mm、尾侧7．5mm区域，变化开始时间分别在伤后48h和72h；另外在损伤中心，灰质区细胞凋亡高峰晚于白质区出现，灰质区凋亡细胞指数在不同时间变化较大。结论 脊髓占位损伤后神经细胞凋亡在不同平面、不同时间存在明显差异。继发性损伤与神经系统固有的传导通路有关，也与损伤信号中介因素有关。