国产因卡磷酸钠对体外破骨细胞性骨吸收的作用

目的 研究国产因卡磷酸钠（ICD）对破骨细胞性骨吸收的作用。方法 采用破骨细胞与骨片的体外共培养法和显微摄片、显微光密度仪扫描及计算机图像分析技术。结果 ICD（0．5,5与50μmol/L）使体外破骨细胞性骨吸收陷窝数目呈剂量依赖性减少,中等浓度（5μmol/L）的抑制作用明显高于阳性对照药帕屈磷酸钠（APD）,两药均可使吸收陷窝表面积明显降低,而且ICD作用更明显。结论 ICD具有较强的直接抑制破骨细胞性骨吸收的作用,对骨质疏松症可能有一定的治疗作用。     

两种破骨细胞培养方法的比较及其吸收骨质的动态观察

目的:比较分析破骨细胞(osteoclast, OC)体外分离培养的方法,并动态观察其形态、分化及功能,为进一步探讨药物对OC性骨吸收的作用奠定基础.方法:采用两种OC的培养方法,即从新生24 h的兔长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast-like cell, OLC)的方法,对获得的OC进行形态学和功能观察.结果: 倒置显微镜下观察,OC是一种多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而变化形态、运动行走;HE染色均可见OC多核、胞浆有空泡;特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色可见OC胞浆阳性,呈酒红色,多核.体外OC与骨片共同培养形成骨吸收陷窝,且在培养的7 d内陷窝数目和面积逐渐增大.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成OLC,其形态结构特征与成熟OC相同,诱导出的破骨样细胞数目多于机械分离的方法,但每个细胞胞核数目总体上少于机械分离的方法,而且胞核多位于细胞周边,在骨片上形成的陷窝也较小而浅;培养液上清中的钙离子含量和酸性磷酸酶(acid phosphatase ,ACP)含量在培养的1～12 d内随时间逐渐增加.结论: 针对不同实验目的可以采用不同的分离培养OC方法.从骨髓腔内壁机械分离培养的方法可获得骨吸收功能较活跃的OC.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成的OLC数量较多,适于对OC分化过程的研究.     

骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的 研究定量检测体外培养破骨细胞（ＯＣ）骨吸收功能。方法 应用改良Ｆｅｎｔｏｎ等的方法，由１ｄ龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离ＯＣ并中于牛皮质骨骨片上连续培养，超声去除细胞后，骨片经１％甲苯胺蓝色３～４ｍｉｎ光镜下对整片吸收陷窝观察并计数，根据骨片上陷窝的数目定量ＯＣ的骨吸收功能。结果 骨片吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别，并为扫描电镜（ＳＥＭ）所证实，甲苯胺蓝染色－光镜观察技术对骨片吸收陷窝计数     

骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的研究定量检测体外培养破骨细胞（ＯＣ）骨吸收功能。方法应用改良Ｆｅｎｔｏｎ等的方法，由１ｄ龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离ＯＣ并接种于牛皮质骨骨片上连续培养，超声去除细胞后，骨片经１％甲苯胺蓝染色３～４ｍｉｎ，光镜下对整片吸收陷窝观察并计数。根据骨片上陷窝的数目定量ＯＣ的骨吸收功能。结果骨片吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别，并为扫描电镜（ＳＥＭ）所证实。甲苯胺蓝染色—光镜观察技术对骨片吸收陷窝计数结果同ＳＥＭ计数结果基本一致（ｒ＝０．９９６７，Ｐ＜０．０５）。结论骨片吸收陷窝光镜计量法评价体外培养破骨细胞骨吸收能力简便、快速、可靠，可用于骨质疏松症病理生理和开发新药的研究     

氟对兔体外破骨细胞性骨吸收影响的研究

目的:探讨不同剂量氟化钠 (Na F)对兔体外破骨细胞功能的影响。方法:从新生兔四肢长骨中分离破骨细胞 ,采用体外培养破骨细胞的方法 ,用倒置相差显微镜和计算机图像分析技术 ,测量在含有不同浓度 (1.0 0×10 - 7～ 1.0 0× 10 - 4m ol/ L )的 Na F培养液中骨吸收陷窝数和表面积。结果:染氟 1.0 0× 10 - 6 、1.0 0× 10 - 5和 1.0 0×10 - 4m ol/ L 组骨片上骨吸收陷窝数量和表面积与对照组比较均减少 (P <0 .0 1) ,而且骨吸收陷窝数及表面积随氟浓度的增加而减少。 结论 :氟对体外培养的破骨细胞有直接的损伤作用。     

OPGL诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞及其破骨活性

目的 :观察在小鼠外周血单核细胞培养中破骨细胞抑制因子配基 (osteoprotegerinligand ,OPGL)诱导单核细胞分化为破骨细胞的作用 ,以及地塞米松对破骨细胞分化和骨吸收活性的影响 .方法 :将外周血单核细胞分组培养 ,在A组中加入巨噬细胞集落刺激因子和OPGL ,B组中再加入地塞米松 .多核巨细胞形成后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartratere sistantacidphosphatase,TRAP)及甲苯胺蓝染色 .将象牙骨片上骨吸收面积经计算机图像分析以确定其差异 .结果 :外周血单核细胞培养 7～ 10d ,可以见到大量的多核巨细胞 ,体积巨大 .B组中 ,多核巨细胞出现较A组早 .几乎所有的多核巨细胞表现为TRAP强阳性 ,而多数单核细胞和巨噬细胞为TRAP阴性或弱阳性 .在象牙骨片上有大量的骨吸收陷窝形成 ,A、B两组的骨吸收无明显差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :OPGL可以诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞并具有骨吸收活性 .地塞米松可加速OPGL诱导的破骨细胞分化作用 ,但对于破骨细胞的骨吸收活性无影响     

葛根素对体外破骨细胞性骨吸收的影响

目的研究葛根素对体外破骨细胞性骨吸收的影响.方法分离破骨细胞,与牛骨磨片共培养,分别加入10-8、10-7、10-6 mol/L的葛根素,以17β-雌二醇10-8 mol/L为阳性对照药,利用相差倒置显微镜观察破骨细胞吸收牛骨磨片的情况.于培养3、5、7 d计数各组骨吸收陷窝数目的变化,并进行显微摄片和图像分析.结果与正常对照组相比,葛根素10-8、10-7、10-6 mol/L及17β-雌二醇10-8 mol/L能使体外培养破骨细胞性骨吸收数目和吸收陷窝面积呈剂量依赖性减少.结论葛根素在体外能直接抑制破骨细胞性骨吸收.     

大鼠骨髓内破骨细胞样细胞形成的实验观察

目的建立大鼠骨髓中破骨细胞样细胞（ＯＬＣ）形成的培养方法,观察１,２５（ＯＨ）２Ｄ３和成骨细胞对ＯＬＣ形成的影响。方法Ａ组,单纯骨髓培养作对照;Ｂ组,骨髓和成骨细胞（来自新生大鼠颅骨）共同培养;Ｃ组,单纯骨髓培养加１,以２５（ＯＨ）２Ｄ３（终浓度１０－８ｍｏｌ）;Ｄ组,骨髓细胞和成骨细胞加１,２５（ＯＨ）２Ｄ３共同培养。培养７天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＣＰ）（＋）多核细胞作为ＯＬＣ的计数、细胞ＴＲＡＣＰ测定和骨片扫描电镜观察。结果骨髓培养开始各组未见ＯＬＣ。培养后Ａ组仍无ＯＬＣ,Ｂ组、Ｃ组偶见少量ＯＬＣ,而Ｄ组多于Ｂ组和Ｃ组（Ｐ＜０．０１）。Ａ组细胞ＴＲＡＣＰ低于其它三组,Ｂ组和Ｃ组低于Ｄ组（Ｐ＜０．０１）。Ｄ组骨片可见吸收陷窝形成,其它三组未发现。结论骨髓培养中ＯＬＣ的形成需要１,２５（ＯＨ）２Ｄ３存在,骨髓与成骨细胞共同培养对ＯＬＣ形成有明显促进作用。     

成骨细胞在破骨细胞性骨吸收中的调节作用

骨组织中含有3种固有的细胞成分,分别是成骨细胞(Osteoblast,OB)、破骨细胞(Osteoclast,OC)和骨细胞(Osteocyte)。它们与骨组织的生成和成熟过程密切相关,其中OB和OC是骨重建中维持骨量的两种主要细胞。本文就成骨细胞在破骨细胞性骨吸收中的调节作用,综述如下。     

小檗碱对大鼠骨髓源性破骨细胞的分化及骨吸收功能的影响

目的：研究小檗碱对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响,探讨小檗碱抑制骨吸收的细胞学基础。 方法：采用原代培养的成骨细胞和骨髓单核细胞联合培养的方法,在1,25-（OH）2维生素D3和地塞米松作用下,使骨髓单核细胞分化形成破骨细胞。通过相差显微镜观察细胞形态,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate—resistant acid phosphatase,TRAP）染色和观察骨片上骨吸收陷窝的形成鉴定破骨细胞。磷酸苯二钠法测定破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性,计算机图像分析技术测定骨片上破骨性骨吸收陷窝的面积。 结果：小檗碱在0．1～10μmol／L范围内,浓度依赖性地抑制TRAP阳性多核破骨细胞的形成和TRAP活性,减少破骨性骨吸收陷窝的面积;在10μmol／L浓度下,对破骨细胞的抑制作用最强,对TRAP阳性多核破骨细胞的形成和TRAP活性的抑制率分别达到了60．45％和42．12％,骨吸收陷窝面积减少72．69％。 结论：小檗碱通过抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收功能减少骨质的丢失。     

唑来膦酸治疗骨转移癌疼痛临床观察

目的:评价国产唑来膦酸治疗恶性肿瘤骨转移疼痛的疗效和安全性。方法:恶性肿瘤骨转移患者42例,随机分配至试验组和对照组各21例分别给予唑来膦酸4 mg与帕米膦酸二钠90 mg静滴,观察其疗效和不良反应。结果:试验组20例总缓解率为90%,对照组21例总缓解率85.7%,不良反应发生率分别为40%和47.6%,两组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:国产唑来膦酸治疗恶性肿瘤骨转移疼痛疗效显著,安全可靠。     

重组白细胞介素2对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响

为了了解重组白细胞介素２对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响，应用体外半固体培养法研究了ｒｈＩＬ－２及其与ＧＭ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ组合对骨髓祖细胞集落形成的调节作用。结果：ｒｈＩＬ－２单独对骨髓造血祖细胞的体外增殖无刺激作用；当其与ＧＭ－ＣＳＦ联合应用时，在浓度为１０．０×１０４～４０．０×１０４Ｕ·Ｌ－１时，ＣＦＵ－ＧＭ集落数明显高于ＧＭ－ＣＳＦ对照组；当其与Ｅｐｏ联用时，在浓度为１０．０×１０４～４０．０×１０４Ｕ·Ｌ－１时ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵ－Ｅ集落数明显高于Ｅｐｏ单用组；但当其浓度升至１０．０×１０５Ｕ·Ｌ－１时，各种集落数均明显减少。重组人白介素２（ｒｈＩＬ－２）对骨髓造血祖细胞体外增殖的研究结果显示，在一定的浓度范围内，ｒｈＩＬ－２与ＧＭ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ联合对骨髓造血祖细胞的体外增殖具有协同的刺激作用，单独应用无集落形成能力，大剂量应用可能会抑制骨髓造血。     

橄榄苦苷对破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影响

目的 探讨橄榄苦苷(oleuropein)对破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的影响及其可能机制.方法 把不同浓度的橄榄苦苷(12.5、25、50 μmol/L)分别加入由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的体外破骨细胞培养体系中,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resist ant acid phosphatase,TRAP)染色方法观察呈TRAP阳性的多核细胞;RAW264.7细胞也用RANKL诱导,用流式细胞仪分析橄榄苦苷对破骨细胞凋亡的影响;在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察骨吸收陷窝,并用图像分析软件统计其面积.采用Western blot法检测橄榄苦苷对破骨细胞特异性蛋白组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、激活T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATC1)及相关信号通路蛋白表达的影响.结果 TRAP染色结果显示,橄榄苦苷能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,且呈浓度依赖性(P＜0.05);橄榄苦苷能下调破骨细胞特异性蛋白CTSK的蛋白表达水平(P＜0.05);橄榄苦苷对破骨细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05);橄榄苦苷能显著减少骨吸收陷窝的面积(P＜0.05);橄榄苦苷能够下调NFATC1及磷酸化p38(p-p38)的表达(P＜0.05).结论 橄榄苦苷可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化以及破骨细胞的骨吸收功能,可能和橄榄苦苷能够下调p38/MAPK信号通路有关.     

人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

目的：建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供更完善的方法。方法：采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色（ALP染色）;利用Percoll 梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs 免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）进行鉴定。结果：体外分离、培养的hMSCs具有独特的细胞免疫学表型, 即CD73和CD105阳性, CD34和CD45 阴性。hMSCs与成骨细胞共同培养5 d后,即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP 染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱导成功的破骨细胞。结论：hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞。     

组织块法与传统破骨细胞培养方法对骨吸收功能的比较研究

目的：比较组织块法与传统破骨细胞培养方法对破骨细胞骨吸收功能的影响。方法：用组织块法与传统破骨细胞培养方法进行破骨细胞培养,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色鉴定破骨细胞,超声去除骨片上细胞后,骨片经1%甲苯胺蓝染色,光镜下观察骨片上吸收陷窝。根据骨片上陷窝数目、面积以及深度定量比较两组破骨细胞骨吸收功能。结果：吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别,组织块法在骨片上的吸收陷窝数目比传统法明显少,而且骨片上陷窝面积及深度也比传统法小而浅（P〈0.05）。结论：组织块法培养的破骨细胞无论从数量上还是从功能上均没有传统法培养的好。数量大的成骨细胞对共培养破骨细胞骨吸收功能起到负面作用。     

三根汤含药大鼠血清对颗粒诱导的破骨细胞形成及其骨吸收功能的影响

目的：研究三根汤含药大鼠血清在体外实验中对颗粒诱导的破骨细胞形成及其骨吸收功能的影响。方法：利用核转录因子-κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子共同诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞。将骨髓巨噬细胞同骨水泥即聚甲基丙烯酸甲酯颗粒按照1：3的比例分别加入至24孔板及装有骨片的96孔板中。50只SD雄性大鼠,随机分成5组,每组10只,分别给予不同药物后,同等条件下提取空白血清、西药（伊班膦酸钠）血清及高、中、低浓度中药（三根汤）血清并分别加入至相应组的培养液中。抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行破骨细胞分化鉴定并计数,计算机图像分析技术测定骨片上骨吸收陷窝的面积。结果：加入含药血清组破骨细胞数量低于空白组（P〈0.05）,西药组与三根汤高剂量组破骨细胞数量低于三根汤中、低剂量组（P〈0.05）,且西药组与中药高剂量组两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。骨吸收陷窝实验显示空白组骨吸收陷窝面积大于其他组（P〈0.05）,西药组与三根汤高剂量组陷窝吸收面积小于三根汤中、低剂量组（P〈0.05）,且两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：三根汤含药血清可以抑制颗粒诱导的破骨细胞的形成及其骨吸收功能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外CFSE染色标记的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）体外分离、培养、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光标记的实验方法。方法差速贴壁离心法分离纯化大鼠BMSCs,并进行表面标志物流式检测鉴定和成脂、成骨分化鉴定。 CFSE标记BMSCs ,荧光显微镜下观察BMSCs 形态和标记率,台盼蓝染色检测CFSE对BM-SCs存活率的影响,以筛选CFSE标记BMSCs的最佳条件。结果第5代BMSCs的特异性表面标志物： CD29阳性,阳性率为90．10％;CD90阳性,阳性率为96．61％;CD45阴性,仅0．40％表达。且BMSCs具有成脂和成骨分化能力。10μmol/L CFSE作用15 min时,BMSCs的CFSE标记率几乎达到100％,且对BMSCs 的活性没有影响（P＞0．05）。结论利用差速贴壁法可获得纯度高、未分化性能强的BMSCs,BMSCs标记CFSE的最佳条件为10μmol/L CFSE作用15 min。     

丁羟茴醚诱导幼儿骨髓间质干细胞分化为神经细胞

目的:探讨幼儿骨髓间质干细胞诱导分化为神经干细胞及神经细胞的方法及生物学特征,为临床利用骨髓间质干细胞或/和造血干细胞治疗小儿脊髓栓系综合征及其它神经系统疾病奠定基础。方法:取健康幼儿骨髓分离纯化骨髓间质干细胞,在α-MEM培养基(含20%胎牛血清,2 mmol/L谷氨酰胺,100 U/ml盘尼西林,100 mg/ml链霉素,25 ng/ml两性霉素B)中进行无分化培养,将传代细胞用丁羟茴醚(ButylatedHydroxyanisole,BHA)诱导,诱导剂是无血清DMEM培养基:含2%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、150μMBHA。结果:骨髓间质干细胞经过7 d体外诱导,大约有55%的细胞发生形态学变化,最初是胞体变圆,随后延展出长长的神经丝并相互交织成网,免疫组化结果表明这些细胞beta-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)和神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达阳性。结论:儿童骨髓间质干细胞在合适的诱导剂作用下体外可定向分化成神经元和神经胶质细胞。为小儿脊髓栓系综合征及其它神经系统疾病自体骨髓移植实验治疗奠定了基础。