SARS冠状病毒核衣壳蛋白的克隆表达及其临床应用研究

目的　克隆、原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)核衣壳 (N)蛋白 ,分析、评价其抗原性和在SARS血清学诊断中的应用价值。方法　采用逆转录巢式聚合酶链反应 (RT-nested PCR)扩增SARS CoV的N蛋白基因 ,克隆入pBAD-Thio TOPO原核表达载体 ,表达、纯化重组融合N蛋白 ,WesternBlot分析其抗原性和特异性 ,建立以重组N蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法 ,并与以全病毒裂解液为抗原的ELISA法进行比较。结果　重组表达载体经诱导产生了高水平的重组融合N蛋白 ,融合蛋白经亲和纯化后 ,具备了较高的纯度和抗原反应性 ,以重组蛋白为抗原的ELISA法在特异性和敏感性方面优于以全病毒裂解液为抗原者。结论　重组SARS-CoV的N蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,可作为新一代SARS-CoV抗体检测试剂盒的备选抗原     

SARS患者组织中冠状病毒S蛋白的表达

目的探讨冠状病毒S蛋白单克隆抗体在5例严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)患者多脏器穿刺和尸检病理组织中的表达以及与SARS病理学特点及病原学的关系。方法应用SARS冠状病毒(SARSCoV)S蛋白单克隆抗体,对病程为1周的早期SARS死亡尸检病例和4例病程为3～5周中晚期SARS死亡病例的多器官组织进行检测和观察。结果肺泡腔内脱落的上皮细胞、单核细胞和多核合体样细胞,以及支气管黏膜上皮细胞与黏膜腺体上皮细胞、多器官内血管内皮细胞和散在浸润的单核巨噬细胞SARSCoVS蛋白均呈阳性表达。2例SARS中晚期病例肝细胞和心肌细胞亦见SARSCoVS蛋白阳性反应。结论SARSCoV单克隆抗体在SARS患者肺、支气管、肝脏和心肌等器官组织均有表达,可作为SARS病原学和病理学的辅助诊断标志,对探讨SARS传播途径及发病机制有重要意义。     

SARS冠状病毒编码蛋白质及其基因分析的研究进展

20 0 3年初 ,一种严重的急性呼吸综合征 (severeacuterespiratorysyndrome,SARS)从我国广东省迅速向周边地区蔓延。直到 6月 4日 ,世界卫生组织 (WHO)共接到来自全球 2 9个国家和地区累计 84 0 2起病例报告 ,其中国内就有 5 32 9人感染。在WHO的协调下 ,全球 10个国家的 11个实     

重组SARS冠状病毒棘突蛋白S1区基因片段的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)棘突(spike)蛋白(S蛋白)S1区基因(40～2001bp)分段表达载体,并研究其免疫原性。方法利用PCR技术扩增S1区基因,将其定向插入pQE30质粒,在pQE30质粒上将S1切成3段(40～751、746～1344、746～2001bp),均插入pQE30质粒,构建质粒在大肠埃希菌M15中表达,表达产物经亲和层析纯化及WesternBlot和ELISA鉴定。结果构建的3种重组质粒(pQE30/S1a、pQE30/S1b、pQE30/S1c)均高效表达,重组蛋白相对分子质量分别为26700、22500和46000,表达量分别占菌体总蛋白质的35%、35%和30%。3种重组蛋白经Ni亲和层析树脂得到成功纯化。经Western-Blot及ELISA证实,重组蛋白片段S1c(746～2001bp)可以被SARS患者血清所识别。结论成功构建了SARS-CoVS蛋白S1区基因分段表达载体,重组蛋白S1c具有较强的免疫原性,它的获得为下一步疫苗的研制奠定了基础。     

双抗原夹心法ELISA在检测抗肾综合征出血热总抗体中的应用

目的建立可以检测不同来源血清中抗汉坦病毒抗体的简单、灵敏的方法。方法汉坦病毒核蛋白重组表达纯化后，同时作为捕获作用的固相抗原和检测作用酶标记抗原，建立检测血清中抗汉坦病毒总抗体的双抗原夹心法ELISA法，并与常用的IFA法进行比较分析。结果检测不同血清时特异性为100％，敏感性高于IFA法4～8倍。且不需考虑更换检测试剂，不同来源的血清样本对检测结果没有明显的影响。结论本方法操作简单，成本低，具有较高的敏感性和特异性，适合用于汉坦病毒感染的监测、调查和临床诊断以及宿主动物间病毒感染流行的调查与监测。     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究

目的：构建抗原基因为SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoY）S蛋白C端片段基因的DNA疫苗，采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况。方法：将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫，定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平，流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化，免疫组化检测抗原表达分布，脾细胞增殖实验评价CTL效果。结果：疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体。随着时问的延续，抗体水平逐步升高，至30天后达到稳定，以CTL为主的CD8^＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著，引起强大的体液免疫和细胞免疫；疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达；而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论：以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

SARS冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其活性测定

严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）病原体是SARS冠状病毒（SARSCoV）,研究开发安全有效的SARS-CoV疫苗以控制SARS成为热点.经过对12株SARS冠状病毒基因序列比较,发现S蛋白的氨基酸突变率仅为0.23%,其较高的保守性为疫苗研究奠定了良好的基础,由此,S蛋白成为候选疫苗的重要靶位.pcDNA3.1（＋）是一种高效率的质粒型真核表达载体.本研究将SARS-CoV的S1基因片段连至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组pcDNA3.1（＋）/S1并初步研究其免疫效果.     

SARS冠状病毒研究进展

2003年初,不明原因的非典型肺炎从我国广东省迅速向周边地区蔓延。3月15日,世界卫生组织（WHO）将广泛流行的、发病急、传播快、严重威胁患者生命的“非典型肺炎”命名为严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）。SARS的潜伏期为2-12 d,主要临床表现有高热（〉38℃）、头疼和干咳,部分病人有气促等呼吸困难症状,少数进展为呼吸窘迫综合征（ARDS）,后者死亡率极高。同年4月16日,在日内瓦举行的9国科学家会议上,WHO正式确定非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种,并将其命名为“SARS冠状病毒（SARS-CoV）”。现就该病毒的研究进展作一综述。     

SARS病毒S蛋白片段与细胞结合作用分析

目的研究SARS冠状病毒(SARSCoV)S蛋白片段与SARSCoV敏感细胞Vero的相互作用,明确S蛋白的受体结合位点。方法在E.coli中表达S蛋白第260～600位氨基酸(S260600)和397～796位氨基酸(S397796)片段,通过Westernblot对蛋白表达进行确认,用NiSepharose螯合层析对重组蛋白进行纯化。将纯化的S260600和S397796蛋白与Vero细胞4℃共同孵育1h后,先后与SARS患者血清及FITC标记的抗人IgG作用,通过流式细胞仪检测蛋白与细胞表面受体的结合情况。结果成功构建了原核表达质粒pET30a/S260600和pET30a/S397796,并表达、纯化出S260600和S397796重组蛋白。分别用SARS患者血清和抗6×His单克隆抗体进行Westernblot检测,证实重组蛋白得到正确表达。流式细胞仪分析显示S260600和S397796重组蛋白均可与Vero细胞发生结合,但S397796的结合力要弱于S260600。同时发现S260600重组蛋白与SARSCoV非敏感细胞NIH3T3细胞不能结合,进一步证明S260600重组蛋白与Vero细胞表面受体的结合是特异性的。结论重组蛋白S397796和S260600具有受体结合能力,尤其S260600包含了重要的受体结合位点,对进一步研究介导SARSCoV感染的细胞表面受体、开展疫苗和抗病毒药物的筛选均具有重要意义。     

SARS-CoV受体ACE-2基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的克隆、真核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)受体ACE2基因,建立安全、可靠的SARS-CoV保护性体液免疫评价体系。方法采用Trizol一步法提取人右心衰心房组织总RNA,逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)扩增ACE2全长基因,克隆人pcDNA4/HisMax-TOPO表达载体,重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,Western Blot检测其真核表达;建立细胞融合抑制实验以检测SARS-CoV中和抗体,并与SARS-CoV假病毒中和试验进行平行比较。结果重组质粒可在真核细胞中表达ACE2蛋白,其蛋白表达细胞可与S蛋白表达细胞产生细胞融合现象,并可用于中和抗体的检测;其结果与SARS-CoV假病毒中和试验较为一致。结论克隆和真核表达了SARS-CoV受体ACE-2基因;基于其蛋白真核表达的细胞融合抑制实验可用于SARS-CoV中和抗体的检测。     

SARS-CoV核衣壳蛋白用于SARS血清学诊断的研究

目的　研究SARS患者血清中抗SARS冠状病毒 (SARS CoV)核衣壳 (N)蛋白特异性抗体的产生规律 ,评价N蛋白在SARS诊断中的作用。方法　采用间接ELISA法测定 2 5 0例临床确诊、1 88例临床疑似、6 2例临床排除SARS患者血清中针对N蛋白IgG抗体 ,并与其SARS CoVIgG总抗体水平进行比较。结果　临床确诊病例针对N蛋白和全病毒特异性抗体IgG的阳性率均随着病程的延长而增高。N IgG在发病第 1周检出阳性率为 3.4 5 %(4 1 1 6 ) ,第 2周为 6 1 .76 %(42 6 8) ,第 3周为81 .82 %(1 8 2 2 ) ,2 2～ 93d达到 1 0 0 %(44 4 4) ;SARS CoVIgG第 1周检出阳性率为 4 .31 %(5 1 1 6 ) ,第 2周为 5 5 .88%(38 6 8) ,第 3周为 77.2 7%(1 7 2 2 ) ,2 2～ 93d达到 1 0 0 %(44 4 4) ;临床疑似病例N IgG检出阳性率为 3.1 9%(6 1 88) ,SARS CoVIgG检出阳性率为 2 .6 6 %(5 1 88) ;临床排除病例N IgG和SARS CoVIgG检出阳性率均为 6 .4 5 %(4 6 2 )。两种方法检测阳性率差异无统计学意义 (χ2 =0 .1 80 ,P <0 .0 0 1 ) ;两者之间符合率为 98.2 0 %(491 5 0 0 ) ,正常人群SARS CoVN IgG阳性率为 1 .88%(1 4 74 5 )。结论　SARS CoVN重组蛋白对于SARS诊断试剂的研究具有重要价值。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达

目的　克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因 ;经克隆和测序分析后 ,亚克隆至表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定 ;阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ;大量诱导表达N蛋白 ,亲和层析予以纯化 ;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果 ;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答。结果　RT PCR扩增出N蛋白基因的特异片段 ,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为 99.8% ;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX 4T 2 ,在JM10 9中表达了N蛋白 ,表达的蛋白经亲和层析获得纯化 ;纯化蛋白能被SARS病人血清识别 ;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体。结论　成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性。     

冠状病毒感染细胞抗原片法检测SARS患者血清中特异性抗体

目的：检测SAILS患者血清中特异性抗冠状病毒抗体及其滴度变化，协助临床确诊SAILS。方法：用本次爆发SAILS患者鼻腔抽吸液分离的冠状病毒感染新生恒河猴肾细胞，制备抗原片，用间接免疫荧光法检测患者体内急性期和恢复期血清中的抗冠状病毒抗体。结果：汕头地区7例SAILS患者血清内均有特异性抗冠状病毒抗体，且恢复期抗体滴度比急性期的滴度增高4倍以上。结论：用冠状病毒感染细胞抗原片对怀疑感染SAILS的患者血清进行特异性抗体检测，可协助临床确定SAPS的诊断。     

SARS冠状病毒的病原生物学分析及其启示

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is the first new epidemic of the twenty - first century. A novel coronavirus (SARS - CoV) has been identified as the causative agent of SAP, S. The genome of SARS - CoV has 29,727 nucleatides in length. The genome organization, with 11 open reading flames, is similar to that of conronaviruses.Phylogenetic analyses and sequence comparisons showed that SARS- CoV is not closely related to any of the known coronaviruses, indicating neither a mutant nor recombinant of well -characterized coronaviruses. It is a complete new coronavirus from nonhuman hostPathological studies show that severe immune response, associated to cytokine dysregulation, may be related to the lung damage of fatal SRAS. Recombination of genomes of wild - type strains with vaccine coronavirus is a potential risk associated with the application of living attenuated coronavirus vaccines. The proteinases, controlling the activities of the SARS- CoV replication, and spike protein, involved in viral entry and pathogenesis, represent attractive targets of anti- SARS drug development. Comparative full-length genome sequence analysis of 14 SARS coronavirus isolates suggests a remarkable genetic conservation of the virus. Anti - SARS vaccine and drug development will benefit from this genetic conservation. SARS-CoV is not likely to change rapidly and thus may not readily mutate to a benign infection. The progress in anti - SARS research has been impressive. However, one of the most effective tools in the control of the SARS is quickly tracing and isolating the contacts of stricken patients before they spread the virus further.     

灭活SARS冠状病毒疫苗对小鼠脏器影响的实验研究

目的:探讨灭活SARS冠状病毒疫苗对小鼠是否有损伤作用。方法:用灭活SARS冠状病毒分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠;ELISA法检测小鼠血清中抗SARS冠状病毒抗体水平;免疫8周后取小鼠各脏器,观察其病理形态学改变。结果:免疫8 d后,小鼠血清中就可检测到特异的IgM、IgG抗体;组织切片染色观察,可见少数小鼠肺及肝组织出现轻度损伤,其他脏器未见病变。结论:SARS冠状病毒灭活疫苗可诱导小鼠产生特异性抗体,同时没有造成严重的器官损伤。这将为SARS疫苗进入临床研究打下基础。     

Cloning, sequencing, expression, and purification of SARS-associated coronavirus nucleocapsid protein for serodiagnosis of SARS

A novel coronavirus has been associated with a worldwide outbreak of atypical pneumonia referred to as Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS-CoV). SARS-CoV nucleocapsid (N) protein has been cloned sequenced and expressed in Escherichia coli strain. Purified N protein was used to measure the SARS-CoV specific IgG antibodies from 16 SARS-CoV infected patients' sera and from 131 control subjects using ELISA assay. Specific antibody responses to the purified recombinant N protein after 10, 20, and 30 days of disease onset were observed in 13 of 16 (81.3%), 16 of 16 (100%) and 16 of 16 (100%) SARS patients sera, respectively. Comparison of detection results with a commercially available diagnostic kit coated with a mixture of SARS-CoV viral proteins showed 9 of 16 (56.3%), 13 of 16 (81.3%), and 15 of 16 (93.7%) positive responses, respectively. None of 131 control sera gave positive reaction in either assay. This data suggests that the N protein of SARS-CoV is immunodominant and this ELISA based test assay for detecting the SARS-CoV N antigen may hold a significant value for SARS diagnosis.     

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的：在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白，并构建其DNA疫苗。方法：构建含N基因的原核表达载体pQEN，并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用NP亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中，构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清，并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果：重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应；SARS—CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论：重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位，可作为用ELISA法检测SARS—CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体，从而为该疫苗的开发奠定了基础。