小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异,以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法取昆明小鼠双股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增BMSCs,流式细胞术检测其表面标志物,并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞,比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠BMSCs,随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs,而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1,而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支;化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起,形成神经样结构。结论采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs,通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景: 黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为 神经退行性疾病的治疗提供新的方式。 目的：探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点。 设计：细胞学体外观察。 材料：清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108 L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片。盖玻片上细胞达80%~90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接。免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多。 结论：黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化。 关键词：黄芪;骨髓间充质干细胞;神经干细胞;诱导分化     

香丹注射液诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：选择一种高效、细胞损伤低的诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的方法是其应用于临床的前提。 目的：拟采用传统中药香丹注射液联合生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子的诱导作用进行比较。 设计、时间及地点：免疫细胞化学水平的细胞观察实验,于2006-09/2008-04在潍坊医学院组织胚胎学教研室完成。 材料：人脐血标本取自潍坊市妇幼保健院,香丹注射液的有效成分为丹参素。 方法：采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,贴壁法筛选出人脐血间充质干细胞,体外扩增,以免疫荧光方法检测表面抗原。分为2组进行诱导分化,香丹注射液联合生长因子诱导组采用30 g/L香丹注射液联合表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子诱导组进行比较。 主要观察指标：采用免疫细胞化学方法和免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志（神经元核抗原、β-TubulinⅢ）和神经胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果：香丹注射液联合生长因子诱导法对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高。脐血间充质干细胞经香丹注射液诱导后出现类似神经细胞的形态改变,胞体呈椭圆形,伸出长突起。免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元核抗原和β-TubulinⅢ,而神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较少。香丹注射液联合生长因子诱导组的 β-TubulinⅢ和神经元核抗原的阳性细胞率显著高于生长因子诱导组（P < 0.05）,神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率明显低于生长因子诱导组（P < 0.05）。 结论：香丹注射液联合生长因子诱导对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高,优于生长因子诱导法。且体外诱导后细胞主要分化为神经元样细胞,而非星形胶质细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景：现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件，及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测，于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。 材料：清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品，成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品，二甲基亚砜为Amresco产品。 方法：Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5×107 L-1。设立2组，诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后，再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1，3，5 h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。 结果：预诱导24 h，胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形，伸出多个短棒状突起，可见2~3个核仁，细胞间漩涡状生长趋势消失，排列无规律；诱导1~3 h，细胞逐渐变圆，胞质收缩明显，折光性增强，双级或多极的突起互相连接呈网状；诱导5 h，突起出现一、二级分支。诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白；3 h后巢蛋白达高峰，同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白；5 h后巢蛋白表达下降，神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化，巢蛋白表达为阴性。 结论：在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导，能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化，且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。     

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

背景：随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立，对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。 目的：研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。 方法：自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株，运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团，加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养。 结果与结论：终末分化细胞光镜下呈团状聚集，RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征，是未来治疗1型糖尿病的可用材料。     

多种神经营养因子联合诱导培养骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞的定向分化

背景：轴突再生后髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。 目的：探讨骨髓间充质干细胞经神经营养因子诱导培养后,向少突胶质样细胞定向分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞分子生物学的体外实验,于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。 材料：选用2~4周龄SD大鼠5只,雌雄不拘,取其双侧股骨、胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞。培养用诱导因子表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子为美国Invitrogen公司产品。 方法：取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL表皮生长因子、N2添加剂的无血清培养基的诱导液诱导48 h后,加含500 ng/mL胰岛素样生长因子1、N2添加剂的分化培养液培养3 d。 主要观察指标：相差显微镜观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用神经元细胞标志物抗微管相关蛋白,星形胶质细胞标志物抗神经纤维酸性蛋白,少突胶质细胞标志物抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质样细胞的阳性率。 结果：①骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞诱导分化过程中的形态学变化：经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达：细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率：在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%。 结论：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞定向分化。     

rhEGF和rhbFGF诱导胎鼠脑组织神经干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的 观察在重组人表皮生长因子和重组人碱性纤维母细胞生长因子诱导下胎鼠脑组织神经干细胞向神经元样细胞分化的超微结构及细胞标志物表型特征.方法 采用孕16 d大鼠胚胎脑组织进行神经下细胞体外分离、培养传代及鉴定,分别于倒置相差显微镜及电子显微镜下观察经体外诱导培养后神经干细胞的组织形态及超微结构变化;免疫细胞化学染色检测神经微丝、微管相关蛋白-2、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸以及多巴胺等蛋白质标志物的表达.结果 倒置相差显微镜观察显示,经体外培养的神经下细胞随着培养时间的延长逐渐形成神经干细胞球体,经体外诱导培养至第7天时即开始出现明显分化趋向,第14天时部分细胞分化发育完全;且蛋白质标志物神经微丝、微管相关蛋白-2、去甲肾上腺索、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸及多巴胺均表达阳性.电子显微镜观察经体外诱导培养至第14天时,细胞出现明显的成熟分化趋向,细胞质中含有大量神经微丝和神经内分泌颗粒,呈典型的神经元分化特征.结论 神经千细胞在体外诱导培养条件下短期即可向神经元方向成熟分化.     

丹参诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元分化

目的：研究丹参对鼠骨髓间充质细胞的分化作用。方法：丹参注射液诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元方向分化，采用免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：丹参可诱导鼠骨髓间充质细胞向神经细胞分化，分化的细胞早期表达巢蛋白和Musashi1蛋白，后期则表达神经元的标志物神经元特异性醇化酶和神经微丝M，在最适合的诱导条件下约50％-60％的细胞表达这两种神经元的标志物。结论：骨髓组织中存在能分化为神经元的干细胞，丹参能够诱导这种干细胞向神经元分化，这种细胞可能成为中枢神经系统自体细胞移植的另一个干细胞的来源。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。