生物活性肽抗肿瘤作用的研究进展

诱导细胞凋亡等多种机制发挥抗肿瘤作用.结论:生物活性肽具有很好的抑制肿瘤生长作用,且毒副反应小,它的开发利用和进一步深入研究具有重要意义.     

高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽对肝癌侵袭和转移的影响

目的 研究高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽(AWYPLPP肽)对肝癌侵袭和转移的影响.方法 采用Matrigel侵袭实验、迁移实验、二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)实验以及黏附实验,探讨AWYPLPP肽对高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3侵袭表型的影响.裸鼠皮下接种HCCLM3细胞,建立肿瘤肺转移模型,观察AWYPLPP肽对HCCLM3肺转移的影响.结果 侵袭实验结果显示,在AWYPLPP肽浓度为0.1～100 μmol/L时,能显著促进HCCLM3细胞的侵袭能力,呈剂量效应关系.迁移实验、MTT实验和黏附实验表明,AWYPLPP肽对HCCLM3细胞的迁移、增殖和黏附能力无影响.HCCLM3细胞皮下接种30 d后处死裸鼠,AWYPLPP肽组出现明显的肺转移,肺转移率为88.9%(8/9),与PBS组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但对皮下肿瘤的生长无明显影响.结论 AWYPLPP肽能促进高转移潜能人肝癌细胞体外侵袭能力以及肿瘤肺转移;进一步寻找肿瘤细胞表面与AWYPLPP肽结合的受体,可能为深入研究肝癌侵袭转移的机制和设计干预治疗的靶点提供新思路.     

NF-kB反义核酸对胰腺癌细胞ICAM-1表达及侵袭转移能力的影响

目的研究核因子-KB（NF-KB）亚单位p65反义寡核苷酸（ASODN）对人胰腺癌细胞细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达及侵袭转移能力的影响。方法设计合成p65ASODN，体外转染人胰腺癌细胞株PANC-1，用流式细胞仪和荧光显微镜检测转染效率，用RT-PCR检测p65及ICAM-1mRNA的表达，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和细胞侵袭实验分析细胞增殖能力和侵袭转移能力的改变。结果p65ASODN可成功转染PANC-1细胞；转染后，p65及ICAM-1mRNA表达明显减弱（P〈0．01）；细胞增殖活性和侵袭转移能力明显下降（P〈0．01）。结论脂质体介导的p65ASODN能有效抑制p65基因的表达，从而降低细胞的侵袭转移能力，p65ASODN可能主要通过下调ICAM-1基因的表达发挥抗侵袭转移的作用。     

β肽及其多聚物对人肝癌细胞株与基质黏附的抑制作用

目的研究β肽及其多聚物对肝癌细胞株与基质黏附的抑制作用.方法观察化学合成的β肽（β肽）、化学合成的二聚β肽（β2肽）、化学合成的三聚β肽（β3肽）、用大肠杆菌表达系统表达的表达β3肽及GRGDS对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞及人肝癌高转移细胞株HCCLM6细胞与纤连蛋白（fibronectin,FN）的黏附作用的影响.结果各种多肽对细胞与FN的黏附均具有特异的抑制作用,呈现剂量效应相关关系和时间效应相关关系（P〈0.05）.且随着多肽重复次数的增多,对细胞与FN黏附的抑制作用越强,表达β3肽和β3肽的抑制肿瘤细胞黏附的作用最强,β2肽和GRGDS的作用次之,β肽的抑制作用最弱.各种多肽对HCCLM6细胞与FN黏附的抑制作用强于对SMMC-7721细胞的黏附抑制作用.结论表达β3肽对肝癌细胞株与基质的黏附具有强大的抑制作用,可能成为抗肿瘤转移的新的药物手段.     

肝细胞肝癌上皮间质转化的相关分子机制

侵袭和转移是造成肝细胞肝癌(HCC)预后不良的重要因素.近年来,HCC上皮间质转化(EMT)已经被认为是HCC侵袭、转移的关键细胞学基础.尽管引起和维持EMT的分子机制并没有被完全阐明,但是转化生长因子-β (TGF-β)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)、细胞核转录因子-κB (NF-κB)、Wnt/β-连接素(β-catenin)等细胞信号通路在EMT过程中的所起到的重要作用已经被证实.上述通路通过调控EMT过程直接或间接影响HCC的预后,这也为HCC的新型靶向药物的研究提供了分子基础.     

修饰的肿瘤抗原肽CEA-610D疫苗的体外抗肿瘤作用

目的: 评价修饰的CEA610D抗原肽疫苗体外抗肿瘤免疫的有效性,为其临床应用提供依据。方法： 多肽固相合成法合成HLAA2 CEA修饰肽(CEA610D)、HLAA2天然肽CEA605613（天然肽）和HLAA2无关肽MAGE3（无关肽）,采用同种异体混合淋巴细胞与肽共孵育的方法,诱导肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),利用MTT法检测CTL的增殖和杀伤活性;流式细胞术观察细胞表型;RTPCR检测细胞穿孔素的表达;ELISA法检测CTL上清中IFNγ的水平。结果：CEA610D疫苗产生肽特异性CTL的能力最强（P<0.05）,其CD8+T细胞数也高于天然肽组和无关肽组;在效靶比为40〖DK〗∶1时,CEA610D和天然肽所诱导的CTL对CEA+HLAA2限制性人结肠癌细胞T84的杀伤活性可达(56.7±3.73)%和(51.2±1.86)%,而3种肽特异性CTL细胞对CEA+HLAA2人结肠癌lovo细胞杀伤活性维持在本底水平;CEA610D组的CTL所释放的杀伤相关介质穿孔素和上清中IFNγ的水平也显著高于其余两组（P<0.01）。结论：与天然肽相比,CEA610D疫苗可打破自身表位的免疫耐受,在体外抗肿瘤免疫中更具优势。     

含甲胎蛋白肽段的重组腺病毒转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应

目的 研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)转染含甲胎蛋白(AFP,137-145)片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的体外杀伤作用.方法 抽取健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含AFP片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC,诱导特异性T细胞.检测体外培养的DC和细胞毒性T细胞(CTL)活性,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用.结果 转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86和IL12,成熟DC诱导的CTL高表达IFNγ;修饰成熟后的DC后体外能诱导特异性CTL,该CTL在休外对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721均有杀伤作用.结论 重组腺相关病毒转染DC,不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖和分化功能,可诱导自体CTL增殖,含AFP(137～145)片断的腺相关病毒转染DC诱导自体CTL对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞有明显杀伤作用,DC疫苗可以作为肝癌患者免疫治疗的有效补充.     

Survivin反义寡核苷酸诱导SMMC-7721细胞凋亡及对化疗药物敏感性作用的研究

目的：观察survivin反义寡核苷酸（ASODN）对SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及其对化疗药物敏感性的作用。方法：设计合成特异性survivin的ASODN，脂质体转染肝细胞癌SMMC-7721细胞，透射电镜观察细胞超微结构变化；RT—PCR法检测survivinmRNA的表达变化；FCM法检测对细胞周期、凋亡及survivin蛋白表达的影响；MTT法测定survivin表达抑制前后细胞对吡柔比星、氟苷、顺铂敏感性的影响。结果：ASODN转染后细胞呈现凋亡的形态学改变，survivin mRNA和蛋白表达减弱（P〈0．05），诱导SMMC-7721细胞凋亡（P〈0．01），细胞周期阻滞于G2／M期（P〈0．05）。ASODN转染组可增加SMMC-7721细胞对吡柔比星、氟苷、顺铂的敏感性（P〈0、01）。结论：Survivin ASODN转染能下调survivin表达，诱导SMMC-7721细胞凋亡，提高对吡柔比星、氟苷、顺铂的敏感性。     

修饰的肿瘤抗原肽CEA_（610D）疫苗的体外抗肿瘤作用

目的:评价修饰的CEA610D抗原肽疫苗体外抗肿瘤免疫的有效性,为其临床应用提供依据.方法:多肽固相合成法合成HLA-A2 CEA修饰肽(CEA610D)、HLA-A2天然肽CEA605-613(天然肽)和HLA-A2无关肽MAGE-3(无关肽),采用同种异体混合淋巴细胞与肽共孵育的方法,诱导肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),利用MTT法检测CTL的增殖和杀伤活性;流式细胞术观察细胞表型;RT-PCR检测细胞穿孔素的表达;ELISA法检测CTL上清中IFN-γ的水平.结果:CEA610D疫苗产生肽特异性CTL的能力最强(P<0.05),其CD8+T细胞数也高于天然肽组和无关肽组;在效靶比为40∶1时,CEA610D和天然肽所诱导的CTL对CEA+HLA-A2限制性人结肠癌细胞T84的杀伤活性可达(56.7±3.73)%和(51.2±1.86)%,而3种肽特异性CTL细胞对CEA+HLA-A2人结肠癌lovo细胞杀伤活性维持在本底水平;CEA610D组的CTL所释放的杀伤相关介质穿孔素和上清中IFN-γ的水平也显著高于其余两组(P<0.01).结论:与天然肽相比,CEA610D疫苗可打破自身表位的免疫耐受,在体外抗肿瘤免疫中更具优势.     

反义端粒酶RNA对肝癌细胞黏附和侵袭的影响

目的:探讨人反义端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)对肝癌细胞系BEL-7402黏附和侵袭的影响及其机制。方法:利用前期实验成功转染端粒酶正、反义RNA基因的肝癌细胞,分为正义转染组(BEL-7402-hTR-EcoRⅠ细胞)、反义转染组(BEL-7402-hTR-BamHⅠ细胞),空白对照组(BEL-7402细胞)。黏附实验和侵袭实验检测反义hTR转染后BEL-7402细胞的黏附和侵袭能力,免疫细胞化学检测整合素β1(integrinβ1,INTβ1)、上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cad)的表达水平,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、-9的活性变化。结果:与空白对照组和正义hTR转染组相比,反义hTR转染组BEL-7402-hTR-BamHⅠ细胞的黏附、侵袭能力明显减低(0.204±0.029vs0.505±0.037、0.465±0.029,34.80±3.19vs71.47±5.15、69.87±3.11,均P<0.05),INTβ1表达降低(0.153±0.016vs0.385±0.008、0.375±0.014,P<0.05),E-cad表达增强(0.209±0.020vs0.124±0.018、0.134±0.016,P<0.05),MMP-2和MMP-9的活性受到明显抑制(2 054.22±138.52vs3 105.56±329.60、2 923.22±269.08,846.33±104.66vs1 538.89±122.85、1 453.33±126.35,均P<0.05)。结论:人反义端粒酶RNA能明显减低肝癌BEL-7402细胞的黏附、侵袭能力,其机制可能与上调E-cad的表达、下调INTβ1的表达,并抑制MMP-2和MMP-9的活性有关。     

αv整联蛋白拮抗剂RGD肽对乳腺癌细胞增殖侵袭能力影响的研究

目的：研究αv整联蛋白拮抗剂RGD肽对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7增殖侵袭能力的影响,探讨其在肿瘤靶向性治疗中的作用机制。方法：化学合成RGD肽,免疫细胞荧光技术检测RGD肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞结合能力；MTT法检测不同浓度RGD肽对细胞增殖能力的影响；流式细胞学检测RGD肽处理对细胞周期和凋亡的影响；Boyden小室体外侵袭实验测定RGD肽处理后细胞迁移与侵袭能力的改变。结果：RGD肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞均有特异性结合作用,15μmoI/L及更高浓度的RGD肽作用24h后细胞增殖能力显著降低(P＜0.01),细胞凋亡明显增加,细胞阻滞于G_0/G_1期,且RGD肽对细胞体外侵袭能力有不同程度的抑制作用。结论：RGD肽作为αv整联蛋白的一种拮抗剂,不仅具有药物、基因治疗载体的导向运输功能,更具有肿瘤的直接杀伤效应,是一种理想的肿瘤靶向性治疗药物。     

三氧化二砷对食管癌细胞侵袭、转移和血管形成的影响

目的　体外实验研究三氧化二砷(As2O3)对食管癌细胞侵袭转移及血管形成的影响及探讨其作用机制。方法　MTT法观察As2O3对ECA109细胞粘附能力的影响;用Boyden Chamber膜侵袭系统观察As2 O3 对ECA109 游走和侵袭以及诱导内皮细胞形成新生血管的影响;免疫细胞化学观察As2O3对ECA109细胞TGF- β1表达的影响。结果:As2O3作用后,ECA109细胞粘贴率降低(P<0.05),游走穿膜细胞数或侵袭穿膜细胞数均明显低于对照组,诱导内皮细胞形成管腔数及长度均低于对照组(P<0.05)。As2O3能降低TGF β1的表达。结论:As2 O3 能有效抑制食管癌侵袭转移及血管形成,其作用机制可能与通过降低TGF β1的表达,抑制食管癌细胞异质粘附、运动能力及血管形成有关。     

RGD与细胞穿膜肽共修饰miRNA脂质体的构建及抗肿瘤研究

目的制备RGD和细胞穿膜肽TAT共修饰载microRNA-34a脂质体(RGD/TAT-miLPs-34a),对其理化性质进行表征,研究脂质体与人骨肉瘤MG63细胞的亲和力和增殖抑制作用。方法采用薄膜分散法制备RGD/TAT-miLPs-34a;定量细胞摄取实验研究MG63细胞对RGD/TAT-miLPs-34a的摄取效率以及对脂质体摄取的影响因素。定性共聚焦实验观察肿瘤细胞对脂质体的摄取。MTT实验研究RGD/TAT-miLPs-34a对MG63细胞的细胞毒性;构建骨肉瘤异位瘤模型,研究不同脂质体对肿瘤的生长抑制率。结果 MG63细胞在与脂质体共同孵育4h后,RGD/TAT-miLPs-34a组摄取效率为(185.3±17.5)%,TAT-miLPs-34a组为(67.5±8.6)%,RGD-miLPs-34a组为(82.7±9.5)%,miLPs-34a组为(40.9±7.8)%,差异有统计学意义,H=27.93,P<0.001。RGD/TAT-miLPs-34a4h摄取效率是2h摄取效率(101.3±12.4)%的1.83倍,差异有统计学意义,z=5.58,P=0.001。骨肉瘤MG63细胞给药48h后,RGD/TAT-miLPs-34a组MG63细胞存活率为(18.5±5.3)%,TAT-miLPs-34a组为(36.1±5.2)%、RGD-miLPs-34a组为(44.8±6.7)%,miLPs-34a组为(67.7±8.9)%,生理盐水组为(98.7±3.6)%,差异有统计学意义,H=19.271,P<0.001。荷瘤裸鼠治疗实验miLPs-34a组对肿瘤生长的抑制率为(19.4±3.2)%,RGD-miLPs-34a组为(39.6±4.8)%,TAT-miLPs-34a组为(42.6±6.5)%,RGD/TAT-miLPs-34a组为(73.7±7.1)%,生理盐水组为0,差异有统计学意义,F=145.237,P<0.001。结论细胞穿膜肽与RGD共修饰载miRNA脂质体能够有效识别并穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞,是一种潜在高效的骨肉瘤靶向给药系统。     

肝癌组织中细胞间粘着分子—1的表达与肝癌侵袭转移关系的研究

目的研究肝癌组织中细胞间粘着分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达与肝癌侵袭转移的关系。方法采用斑点印迹方法测定ＩＣＡＭ－１在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达，分析其与肿瘤生长转移状态和肿瘤特性的关系。结果肝ＩＣＡＭ－１的含量在肝癌组织中明显高于癌旁组织（Ｐ＜０．０１）和正常组织（Ｐ＜０．０１），而与肿瘤大小和有无包膜无关（Ｐ＞０．０５）。有转移组肝癌组织中ＩＣＡＭ－１的表达明显高于无转移组，而癌旁组织中两组无差别。结论ＩＣＡＭ－１有可能作为预测肝癌转移、复发及预后的指标。     

肝癌树突状细胞瘤苗诱导抗肿瘤作用的研究

目的：研究负载肝癌抗原的肝癌树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗诱导的抗肿瘤作用。方法：于体外用rhGM-CSF和rhIL-4从肝癌患者外周血诱导DC,并用肝癌细胞抗原冲击致敏,制成负载肝癌抗原的肝癌DC瘤苗。肝癌DC瘤苗活化自体T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic of T-lymphocytes,CTL）,采用流式细胞术检测CTL分型;乳酸脱氢酸（LDH）4 h释放法检测CTL对肝癌细胞的特异性杀伤作用。MTT法检测肝癌DC瘤苗及其活化CTL培养上清对肿瘤细胞的抑制作用;ELISA法检测肝癌DC瘤苗活化的CTL培养上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α水平。结果：经肝癌DC瘤苗活化后的T淋巴细胞群中,CD56^＋细胞数量显著减少,CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量增加,其中以CD8^＋T细胞增加较明显;细胞毒实验显示,该CTL对自体肝癌细胞具有较强的杀伤作用,而对与致敏DC的肝癌抗原无关的CT26结肠腺癌细胞无明显杀伤作用;单纯肝癌DC瘤苗或其激活的CTL培养上清也表现出较强的抑瘤作用,而且这种抑瘤作用具有广谱性,可抑制多种肿瘤细胞的生长;在CTL培养上清中可检测到IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量。结论：肝癌DC瘤苗不仅诱导了对肝癌细胞的特异性CTL杀伤作用,而且可激活CD4^＋T和CD8^＋T细胞分泌IL-12、TNF-α和IFN-γ等细胞因子,以非杀伤方式直接或间接地抑制肿瘤细胞生长,发挥非特异性的抗肿瘤作用。     

奥曲肽对裸鼠皮下胃癌种植瘤生长及侵袭转移的影响

近年来研究表明胃癌的生长分化受多种胃肠肽类激素的调控，生长抑素（somatostatin，SST）可能起重要的作用。本研究旨在探讨SST类似物奥曲肽（octreotide，OCT）对胃癌裸鼠种植瘤生长及侵袭转移的影响。     

麻醉对肝细胞癌复发转移的影响

肝细胞癌(HCC)是导致癌症死亡的主要原因之一, 术后有较高的复发转移风险, 麻醉方式、麻醉相关用药、术中麻醉管理等可影响HCC的生物学行为或机体免疫, 进而影响HCC的复发转移。关注麻醉对HCC复发转移的影响, 优化麻醉方案, 有望改善患者的长期生存。     

HepaCAM基因转染对肾癌细胞侵袭活性的影响

目的：研究肝细胞黏附分子（hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM）基因转染对肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）细胞株786-0侵袭能力的影响，并探讨其作用机制。方法：将携带hepaCAM基因的重组质粒hepaCAM－pEGFPN2转染786-0细胞后，用G418筛选形成阳性克隆并扩增培养，以转染了pEGFPN2和未转染的786-0细胞作为对照。采用RT—PCR和实时荧光定量PCR法检测hepaCAM和基质金属蛋白酶（matrixmetalloproceinase，MMP）－2和MMP－9mRNA的表达，明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性变化，Transwell小室法检测786-0细胞的体外侵袭能力。结果：稳定转染hepaCAM基因后。786-0细胞的hepaCAM mRNA表达水平明。显上调（P〈0．01），而MMP－2和MMP-9 mRNA的表达和酶活性明显受抑（P〈0．05），hepaCAM基因的导入显著削弱了RCC细胞的跨膜侵袭能力（P〈0．01）。结论：hepaCAM可能通过下调MMP－2和MMP-9的表达以及抑制明胶酶的活性．进而抑制肾癌细胞786-0的侵袭力。