环媒恒温扩增(LAMP)技术在寄生虫检测中的应用

环媒恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种快速、简单、敏感、特异的核酸扩增方法.作为一种新的核酸扩增方法,LAMP法被逐渐应用于寄生虫、病毒、微生物的检测,是最有发展前景的快速诊断方法之一,本文就LAMP技术在寄生虫检测方面的应用发展情况进行综述.     

环介导等温核酸扩增法在基因检测中的应用

环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种操作简单、快速、灵敏度高,而且特异性强的DNA扩增技术,已广泛应用于临床诊断,胚胎性别鉴定,以及细菌和病毒等病原微生物的检测.本文简述了环介导等温核酸扩增技术的原理、特点和在基因检测中的应用,分析了该技术存在的问题,并对该技术未来的发展进行了展望.     

环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用

 环介导等温扩增(LAMP)技术是近年发展起来的一项新的快速核酸恒温扩增技术,具有高效、快速、特异、易检测、易操作等特点,自面世以来被科学家认为是能替代常规PCR的一项扩增技术,非常适用于现场检测和基层检测。本文就LAMP技术的原理、特点、进展及其在病原微生物检测中的应用进行了简要的概述。     

LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）为靶序列,设计6条特异性引物（内引物、外引物和环引物各2条）,优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。     

一种改良的环介导恒温扩增技术在甲型肝炎病毒核酸检测上的应用

目的 建立一种更加快速简便的环介导恒温扩增技术(LAMP)检测甲型肝炎病毒(HAV).方法 本研究通过在传统LAMP的基础上加入加速引物建立了一种改进型的LAMP体系.结果 精确性和可重复性实验证实改进后的HAV LAMP检测体系稳定可靠,重复性强,并且较传统的LAMP灵敏度更高,检测极限可以达到5 TCID50/ml.当该方法用于甲型肝炎患者急性期血清临床样本的检测时,实验结果与TaqMan实时荧光定量PCR的检测结果一致.结论 改进型的LAMP技术有望应用于HAV临床样本检测,同时也适用于HAV流行地区的病原学监测和调查.     

环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较

目的 通过比较环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与实时荧光PCR( real-time PCR)技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异,寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法 根据问号钩端螺旋体lipL41基因序...     

使用环介导等温扩增技术快速检测金黄葡萄球菌的初步研究

目的 探索建立一种快速的、简单的检测金黄葡萄球菌的环介导等温基因扩增方法(100p-mediated isothermal amplification,LAMP).方法 针对金黄葡萄球菌clfA基因保守序列,根据LAMP方法的原理,设计LAMP检测反应体系和程序,对方法的特异性、灵敏度、重复性及初始拷贝数的对数值与反应时间(荧光信号值为1×10~4时对应的时间)之间的线性关系进行评估.结果 使用LAMP方法可以在0.5 h内获得检测结果,LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上,与其他相关致病菌无交叉反应,平均试验间变异系数小于5%,反应时间与模板浓度有良好的线性关系(r~2=0.9501),LAMP法检测临床样本中金黄葡萄球菌的灵敏度为100%,特异度为94.4%,符合性为96.6%.结论 该方法快速、灵敏、特异、操作简单、设备要求低的特点适合基层医疗卫生机构和现场查验机构的广泛应用.     

环介导等温扩增技术及其在肝炎病毒检测中的应用

环介导等温扩增技术LAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification)是近年来发展起来的新的核酸扩增技术,与传统的核酸扩增方法相比,它具有高特异性、高效性、快速、操作简便等特点.目前在病原微生物检测、食品安全、环境监测等方面有广阔的应用前景,本文就环介导等温扩增的原理、技术特点及在肝炎病毒检测中的应用进展进行综述.     

环介导等温扩增技术检测卡氏肺孢子虫的研究

目的 环介导等温扩增(LAMP)技术检测卡氏肺孢子虫(Pc).方法 醋酸可的松经皮下注射Wistar大鼠诱导Pc,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)提取Pc基因组DNA.设计4条扩增Pc线粒体核糖体大亚基(mtrRNA)基因的LAMP引物,以结核杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、弓形虫、大鼠白细胞为对照,进行LAMP反应.LAMP产物经显色、电泳及酶切鉴定.将Pc DNA 10倍稀释后同时进行LAMP和PCR,比较其敏感性.结果 Pc检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性).Pc LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,扩增产物经Tail限制性内切酶酶切鉴定正确,对照组均无扩增产物.LAMP可检测到虫体DNA的最低浓度是lP9/pJ,为PCR的10倍.结论 检测Pc的LAMP方法敏感、特异及简便.     

人博卡病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

目的 建立环介导等温扩增技术（LAMP）检测人博卡病毒（Human bocavirus,HBoV）基因的方法,并用于检测临床样本.方法 通过在线软件设计工具Ptimer Explorer V4设计HBoV NP-1基因的LAMP引物,建立LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果 与传统PCR方法相比,LAMP法检测灵敏度更高,可达到10拷贝,特异性较强;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到5份阳性.结论 建立HBoV LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,有望进行临床检测HBoV.     

变性高效液相色谱技术快速检测下呼吸道致病性细菌的实验研究

目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测5种下呼吸道致病性细菌,建立一种快速检测下呼吸道致病性细菌的分子生物学方法.方法 以下呼吸道致病性细菌16S rRNA基因的保守区设计通用引物,并在引物前加上40-bpGC,特异性扩增该基因的保守区和可变区,运用DH-PLC技术对PCR产物进行分析.选取50株临床分离菌株验证该方法的有效性.结果 通用引物可特异性扩增细菌16S rRNA,PCR产物经DHPLC分析后每种细菌均能得到特征性的洗脱峰.DHPLC检测临床分离菌株结果显示,与常规培养方法的符合率为100%.结论 DHPLC技术具有准确、简便、快捷和高通量等特点,在临床检测下呼吸道致病性细菌中具有潜在的应用价值.     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法（LAMP）并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2＋浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA（Pv-rDNA）的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当（χ2=0.34,P〉0.05）;特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义（χ2=9.67,P〈0.05）。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

基于环介导等温扩增的志贺菌快速检测方法的建立

目的 建立基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的志贺菌快速检测方法.方法 针对志贺菌特异保守ipaH基因设计引物,通过引物筛选和反应条件优化,建立检测志贺菌的实时荧光及肉眼目视观测结果的LAMP方法,对方法的检出限、有无交叉反应、符合率和抗干扰能力进行评价.结果 60～65℃等温条件下30min内可完成LAMP反应.荧光和肉眼目视观察结果检出限分别为211和21.1 fg/μL,与22种非志贺菌无交叉反应.检测35份志贺菌污染的样品和30份未污染标品,荧光和肉眼目视检测阳性符合率分别为97.1％和94.3％,阴性符合率均为100％,总符合率分别为98.5％和96.9％.方法 具备良好的抗干扰能力.结论 在基层医院、灾区救治、感染事件现场,环境、设备和人员受限等条件下,建立的实时荧光和肉眼目视观察结果的LAMP方法可为志贺菌快速检测提供有力手段.     

逆转录环介导等温扩增检测风疹病毒RNA方法的建立

目的建立逆转录环介导等温扩增快速检测风疹病毒RNA的方法。方法选取保守基因E1设计引物,建立并优化RT—LAMP反应体系,同时进行特异性和敏感性评估。在此基础上应用建立的方法对46例ELISA检测阳性的孕妇血清标本进行检测,并与RT—PCR相比较。结果建立的方法仅对风疹病毒RNA扩增出特有的梯状条带,酶切结果与预期相符。46例孕妇标本经RT—PCR和RT—LAMP检测,分别检出28例和29例。结论该方法特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,有望在临床检测中发挥一定的作用。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

基于LAMP技术建立解脲支原体基因试纸条检测方法

目的 建立一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的方法检测解脲支原体.方法 基于环介导恒温扩增技术(LAMP),根据解脲支原体序列特征设计3对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性.结果 该技术检测解脲支原体较实时荧光PCR技术灵敏度要高10倍以上,其它病原体检测均阴性该方法特异性与实时荧光PCR技术相当.结论 恒温扩增联合试纸条技术检测解脲支原体具有较高的敏感性和特异性,检测速度快,适合各医院开展.     

环介导等温扩增技术可视化检测结核分枝杆菌

为了提升对结核分枝杆菌(MTB)检测的实用性,本文开展了采用环介导等温扩增方法(LAMP)对MTB进行可视化检测的研究。首先,根据MTB 16S r DNA序列设计LAMP引物。然后,收集临床痰液样本并进行相应处理。为了评价LAMP的特异度和灵敏度,本文用电泳产物进行检测并用钙黄绿素进行可视化验证。最后,以细菌培养结果为金标准,用SPSS 17.0软件比较培养结果与LAMP的一致性。结果显示,特异度实验中无非特异扩增现象,灵敏度实验中的检测极限为10拷贝。另外,可视化产物检测方法和电泳后的灵敏性相一致。进一步进行临床实用性评价,灵敏性为94.47%,特异性为90%,与细菌培养无统计学差异,结果一致性较好(P0.05)。综上,LAMP技术高效而可视,具有在设备匮乏的现场和基层医疗机构的应用前景。     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.