恶性疟原虫信号肽肽酶原核表达载体的构建及融合表达蛋白的鉴定

目的构建恶性疟原虫PfSPP基因pMAL-p2x的原核表达载体,并鉴定表达,为其功能研究奠定基础。方法体外培养恶性疟原虫（3D7株和FCR3株）,提取虫体总RNA,进行反转录后,采用RT-PCR扩增PfSPP的全编码区基因,将其克隆入原核表达载体pMAL-p2x,PCR、双酶切鉴定重组质粒,并进行序列测定,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌进行表达获得MBP-PfSPP融合蛋白,采用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pMAL-PfSPP,转化菌经诱导表达出分子量约为77 000Mr的MBP-PfSPP融合蛋白,抗MBP多克隆抗体可特异性地识别表达的融合蛋白。结论成功表达具有多个跨膜结构的膜蛋白PfSPP,从而为深入研究PfSPP的酶活性及生物学功能奠定基础。     

恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的 探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种，诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因，构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E（疫苗D）、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVME（疫苗V）和重组原核表达AMAl胞外域蛋白E（疫苗P）。用疫苗D单独或与小鼠GM-CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫，用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D-V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平，用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上，采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答，小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍，GM-CSF表达质粒对疫苗D-V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D-V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs。pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴肢神经元分化。将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10％,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性。     

人HER2胞外区基因重组及重组蛋白的纯化

为在体外纯化可溶性HER2胞外区蛋白并提高其原核表达产量，将多聚酶链式反应（PCR）方法获得的HER2基因胞外段编码区重组至pGEX-6P-1质粒，转化大肠杆菌BL21，采用不同的诱导条件分析融合蛋白的表达及其溶解性，不溶的包涵体经变性复性，与裂解液上清分别经Olutathione Sepharose4B亲合纯化融合蛋白。结果发现，重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在，但以不溶的包涵体形式为主。低温（30℃）、较高的细菌密度（A600—1．8）和适当的培养基添加剂能有利于可溶性融合蛋白的表达。Olutathione Sepharose4B亲合纯化细菌裂解液上清和复性后的融合蛋白，其产量为1．23mg／L菌液，最大限度地获得了可溶性的HER2蛋白胞外段，为HER2特异性抗体的制备及其功能研究打下了良好的基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在QSG7701细胞中的表达和鉴定

目的：进行丙型病毒肝炎核心蛋白真核表达载体的构建，并在人源肝细胞QSC7701中进行表达与鉴定。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1—3011质粒中扩增出HCV核心（core）基因片段，构建peDNA3．1（-）／core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701，用免疫组织化学SP法检测丙型肝炎病毒核心蛋白的表达，再通过Western blot印迹法进行鉴定。结果：所克隆的core片段大小正确，序列正确；成功的构建了pcDNA3．1（-）／core重组表达质粒，瞬时转染QSG7701细胞，用SP免疫组化检测到了核心蛋白的表达，Western blot印迹法显示其分子量约为21000。结论：丙型病毒肝炎核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）／core在人肝细胞中能有效表达HCV核心蛋白，从而为进一步研究和解析核心蛋白在肝细胞癌变机制中的所起的作用提供了良好的核心蛋白表达系统，同时也为开发丙型肝炎DNA疫苗提供了前期条件。     

人CD7 cDNA在HEK293细胞中的表达

目的 建立表达人白细胞分化抗原CD7蛋白的哺乳动物细胞模型,为深入研究CD7的功能奠定基础。方法 采用PCR方法扩增CD7 cDNA,将目的片段定向克隆于真核表达载体pcDNA3,限制性内切酶酶切分析重组质粒并进行序列测定;通过电穿孔法将重组真核表达载体pcDNA3/CD7转染于人胚肾293细胞（HEK293）,经G418筛选得到抗性克隆;利用FCM检测CD7分子在HEK293细胞的表达。结果 得到了含CD7全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3/CD7。FCM分析表明：转染了pcDNA3/CD7的HEK293细胞表达人CD7蛋白。结论 为深入研究CD7的作用机制提供了条件。     

pEGFP/hVEGF121融合蛋白真核表达载体的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在骨髓间质干细胞（MSC）中的表达。 方法： 采用PCR技术，以pCD/hVEGF121质粒为模板扩增VEGF121基因全长，采用PCR产物的粘端克隆法，将VEGF121定向克隆入pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP/hVEGF121重组质粒，酶切、PCR及序列分析鉴定，脂质体介导转染体外培养的MSC，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达。 结果： PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF121正确连接至pEGFP-C1的多克隆位点，pEGFP/hVEGF121重组质粒转染MSC后，荧光显微镜及免疫细胞化学检测EGFP/VEGF蛋白在MSC中存在表达。 结论： 成功构建了携带人VEGF121及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒，并在MSC中获得表达，为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病及MSC的分化奠定了实验基础。     

大鼠IgE依赖组胺释放因子重组蛋白纯化效果的优化

目的提高大鼠IgE依赖组胺释放因子（rHRF）的可溶性表达水平，改善其亲和层析纯化效果，为深入研究该重组蛋白的生物学功能奠定基础。方法选择多克隆酶切位点BamH Ⅰ和Xho Ⅰ,将rHRF完整编码区基因从原有的pET-30a—rHRF重组质粒亚克隆至pET-28a载体，构建重组质粒pET-28a-rHRF;转化大肠杆菌BL21（DE3）后，通过改变IPTG浓度（0．1～1．0mmol／L），调节诱导表达温度（25～370C）和时间（1-5h），筛选能够提高rHRF可溶性表达水平的条件；同时改进亲和层析纯化的条件，提高纯化效果。结果成功构建重组质粒pET-28a-rHRF，不同IPTG浓度、诱导温度和时间对重组蛋白的可溶性表达水平无明显影响。但是．与pET-30a-rHRF转化菌相比，pET-28a—rHRF转化菌所表达的重组蛋白因其N端和C端均带有6xhis标签．增强了目的蛋白与树脂的结合力，而使亲和层析纯化效果（重组蛋白的浓度和纯度）显著提高。结论rHRF重组蛋白的可溶性表达水平不受IPTG浓度、诱导表达温度和时间的影响，但是可溶性重组蛋白两端均携带6xhis标签可使亲和层析纯化效果显著提高，从而有利于获得足量rHRF用于进一步的生物学功能研究。     

恶性疟原虫已糖转运体编码基因的体外扩增及克隆

目的：体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因(PfHT1)，并将该基因克隆至pEGFF真核表达载体内使其高效表达，为研究DNA疫苗创造条件。方法：特定PCR引物的设计；恶性疟原虫FCC1／HN株的体外培养；提取基因组DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析；酶切、连接及PCR分析鉴定。结果：从恶性疟原虫簿南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码FfhTl的基因序列．片段太小为1516bp，克隆鉴定结果表明插人片段大小正确。结论：体外成功扩增出恶性疟原虫PfHTl编码序列，与预期长度相符，并成功构建pEGFF-Htl真核表达载体。为研究其结构、功能和免疫原性奠定基础，     

VEGFR-2胞外段DNA疫苗的构建与表达

目的构建VEGFR-2胞外段基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增VEGFR一2分子胞外段编码基因FLK1 265-2493,先将该片段插入到pMDT-18载体中,再亚克隆至真核表达载体pSC．SS．YL,构建VEGFR-2分子胞外段编码基因表达质粒。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pSC．SS．FLK1265-2493．YL转染COS-7细胞,检测其体外表达。结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在。结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础。     

含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用

目的：构建含3C蛋白酶酶切位点的人CD226(PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体，并进行表达和初步鉴定。方法：将人CD226分子的胞膜外区基因，克隆入含3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体p-3c—Ig中。测序证实后，转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析件纯化，并通过免疫荧光染色及3C蛋白酶酶切反应进行鉴定结果：经表达和纯化获得CD226胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV304细胞表面的CD226配体有效结合。同时，融合蛋白的Fc段亦经3C蛋白酶切除，从而获得CD226胞膜外区的真核表达分子。结论：成功地获得了含有3C蛋白酶酶切位点的人CD226分子胞膜外区Ig真核表达产物，为进一步对CD226分子进行结构和功能研究，以及X线结晶衍射提供了重要条件。     

非编码基因MALAT1功能性序列真核表达载体的构建及其在SW620细胞中的表达

目的构建人肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）功能性序列重组真核荧光表达载体,并在人大肠癌SW620细胞株中表达。方法采用RT-touchdown PCR方法,从人正常大肠黏膜组织中提取总RNA,扩增MALAT1功能性序列,将扩增产物克隆至pTA2载体,测序证实后,克隆至pEGFP-C1质粒中,构建重组真核荧光表达载体;阳离子脂质体介导下转染人大肠癌SW620细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。通过Real-time PCR检测质粒转染前后MALAT1/fgf mRNA表达水平的变化。结果经pTA2载体和pEGFP-C1载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实人MALAT1功能性序列重组真核荧光表达载体构建成功。在荧光显微下观察到带绿色荧光的SW620细胞。pEGFP-C1-MALAT1/fgf转染前后SW620细胞MALAT1/fgf mRNA表达水平倍比关系为2.376±0.573,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了人MALAT1功能性序列真核荧光表达载体pEGFP-C1-MALAT1/fgf,转染SW620细胞后可引起MALAT1/fgf mRNA表达上调,为进一步研究MALAT1的结构、功能及其与人大肠癌的关联奠定了基础。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

鼠表皮生长因子受体胞外段原核表达、纯化与复性

用多聚酶链反应(PCR)方法从既往构建质粒扩增鼠表皮生长因子受体(EGFR)胞外段基因及适宜酶切位点，进而构建原核表达载体。克服质粒丢失的不足，在大肠杆菌中表达目的蛋白，并在变性条件下通过。Ni^2 柱亲和层析纯化表达蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)示纯度在95％以上。去除组氨酸标记的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。复性蛋白在表皮生长因子的作用下可以同源二聚化而在非还原SDS—PAGE及蛋白印迹分析中呈二聚体状态，其所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于肺癌细胞上的EGFR，提示复性后大肠杆菌表达鼠EGFR胞外段重组蛋白已获得一定空间结构，并具有免疫原性，可以进一步用于EGFR功能及免疫学研究。     

hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定

目的获得高效表达hDll1ext-Fc融合蛋白的细胞系以及具有生物学活性的目的蛋白。方法根据已知序列设计引物,并将hDll1ext基因片段经PCR扩增,酶切后连接至pIRES2-EGFP-Fc中,挑选阳性克隆测序,将正确的重组质粒转染至CHO-S细胞,筛选高表达细胞系,利用rProtein A亲和柱纯化目的蛋白,并通过检测Notch下游信号分子Hes1的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。结果构建了pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc真核表达载体,并筛选了高效表达hDll1ext-Fc的CHO-S细胞系,纯化得到较高纯度的融合蛋白,配合生物活性检测实验显示,可溶性的hDll1ext-Fc能够激活Hes1报告基因,并且能上调Notch下游分子Hes1的表达,证明其能够激活Notch信号通路。结论在CHO-S细胞中成功表达了hDll1ext-Fc融合蛋白,为进一步研究Delta-like-1的生物学功能奠定重要基础。     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。