锅柄聚合酶链反应法扩增贵阳腐霉Pr1基因上游未知序列

目的：在灭蚊真菌贵阳腐霉Pr1基因已知序列的基础上,利用锅柄聚合酶链反应法扩增Pr1基因上游未知序列。方法首先采用限制性内切酶BamHⅠ对基因组DNA进行完全酶切,用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后,与5′磷酸化的寡核苷酸链连接,经过变性、链内退火和聚合酶延伸形成锅柄状,最后进行嵌套式PCR。结果获得了Pr1基因已知序列上游864bp核苷酸序列,GenBank登录号为：JQ975036。结论锅柄聚合酶链反应法可以高度有效地扩增与已知位点相邻的基因组片段,是一种可靠的染色体步移法,有利于Pr1基因全长的克隆。     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因5'上游的克隆与序列分析

目的：克隆盐藻2种碳酸酐酶基因(DCA1、CA1)5’上游区序列，并对其进行测序和序列分析。方法：利用Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、PvuⅡ和StuⅠ4种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与衔接头连接，构建成盐藻步行基因组文库GWL1、GWL2、GWL3和GWL4；巢式PCR方法从盐藻步行基因组文库中扩增DCA1和CA1基因5’上游区序列，双脱氧末端终止法测序。结果：DCA1基因，在GWL1、GWL3中分别扩增出约1．3kb和4、5kb的特异带，而CA1基因，则在GW12、GWL4中分别扩增出1．7kb和2．5kb的特异带；序列分析结果表明，所得序列的3’端与已知DCA1、CA1基因cDNA5’端序列完全一致。该2序列均有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA—box、CAAT—box)和富含GT的重复序列等许多相似之处。结论：采用基因组步行方法从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的DCA1、CA1基因的5’上游区序列，可能是2种新的杜氏盐藻碳酸酐酶基因的启动子区序列。     

人CCR5 5′侧翼调控序列克隆测定及基序分析

目的：克隆人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列及其基序分析。方法：设计单引物,利用单向多循环ＰＣＲ扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ,ＰＣＲ产物作为序列分析模板。结果：得到长为１．５ｋｂ的人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ序列,并对该区域的基序进行了分析。结论：该方法适合于基因组ＤＮＡ,特别是逆向扩增一些读框区５′侧翼调控序列。     

A simple method for purification of genomic DNA from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier

Objective： To establish a method of genomic DNA extraction from whole blood using Fe3O4/Au composite particles as a carrier. Methods： Two crucial conditions （sodium chloride concentration and amount of the magnetic particles） were optimized and 8 different human whole blood samples were used to purify genomic DNA under the optimal condition. Then agarose gel electrophoresis and polymerase cbain reaction （PCR） were performed. Results： The optimal binding condition was 1.5 mol/L NaC1/10% PEG, and the optimal amount of Fe3O4/Au composite particles was 600μg. The yields of the genomic DNA from 100μl of different whole blood samples were 2-5 μg, and the ratio of A260/A280 was in the range of 1.70-1.90. The size of genomic DNA was about 23 kb and the PCR was valid. Conclusion： The purification system using Fe3O4/Au composite microparticles has advantages in high yield, high purity, ease of operating, time saving and avoiding centrifugation. The purified sample was found to function satisfactorily in PCR amplification.     

Sequence determination of exp- 1 Gene of Plasmodium Falciparum Isolate FCC1／HN

目的 测定恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因序列。方法 根据exp-1基因已知序列设计合成1对引物，用PCR技术从FCCl／HN株基因组DNA中扩增exp-1基因；将exp-1基因克隆入pMD-18T载体，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，铺x—gal LB平板；挑取阳性菌落，用酶切，PCR扩增进行鉴定。以正确的重组质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定exp-1基因序列。结果 从恶性疟原虫FCCl／HN株基因组DNA中获取exp-1基因，成功克隆入pMD-18T载体；测序表明FCCl／HN株exp-1基因全长937bp，编码162个氨基酸。结论 克隆了恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因，并测定了其核苷酸序列，为进-步研究其功能奠定基础。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

精子特异性Sleeping Beauty转座酶转基因小鼠模型的建立

目的建立精子特异性表达Sleeping Beauty(SB)转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具。方法克隆精子特异性启动子用以驱动SB转座酶基因的表达,建立精子特异性表达SB转座酶的载体,利用显微注射方法建立以C57BL/6J为背景的精子特异性表达SB转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定首建鼠的基因型,western blot(WB)和免疫组织化学(IHC)检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果显微注射方式获得了5只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在精子中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了精子特异性高表达SB转座酶转基因小鼠模型,为将SB转座子作为一种基因工程工具应用于小鼠基因修饰模型的建立提供非常重要的工具资源。     

Cloning of NHE-1 gene fragment from human lung can.cer cells and construction of its antisense expression vector

Objective: To clone the partial sequence of Na^ /H^ exchanger- 1 (NHE- 1) gene of human lung cancer cells and insert it reversely into the multiclone site of pLXSN in order to construct an antisense expression vector for tumor gene therapy it~ vivo. Methods: With use of the upstream and downstream primers containing Barn H I and EcoR I in their 5‘ ends respectively, a partial sequence of the first exon of NHE-1 gene was cloned in a length of 454 bp from genomic DNA of human lung cancer cell A549 with PCR method. The product was then direetionally and reversely insert into the multiclone site of pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results: The cloned fragment was 461 bp in length and successfully ligated to pLXSN with the identification by agarose gel etectrophoresis. DNA sequencing confirmed that the fragment cloned and inserted into the vector was identical with the targeted one. Conclusion: The targeted fragment is successfully cloned and reversely inserted into pLXSN in our experiment. The antisense expression vector of NHE-1, pNHE-1, was constructed successfully.     

利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型

目的 利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法 在线设计Txnip敲除位点, 构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性, 体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵, 对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果 在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点, 并在细胞水平验证具有剪切活性, 注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠, 其中2只Txnip发生移码突变, 成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论 通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

核酸序列水平定位DNA损伤的实验研究

目的 研究在核酸序列水平定位DNA损伤的方法.方法 培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针.酶切基因组DNA构建损伤模型,应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)进行Southern blot,对产物进行测序.结果 酶切DNA的RDPCR产物在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤位于HinfⅠ在k-ras外显子2的酶切位点.结论 将RDPCR和测序技术结合在一起,可在核酸水平上准确定位DNA损伤的碱基位置.     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定

目的：克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因跨内含子基因组DNA序列。方法：利用跨内含子PCR方法,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果：DCA1基因跨内含子长度为4407bp,含7个外显子,由此推定的氨基酸序列长度为555个氨基酸残基;而CA1基因跨内含子长度为4473bp,含8个外显子,其推定的氨基酸序列长度为498个氨基酸残基。这2种基因的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT—AG规律。结论：首次克隆得到了杜氏盐藻DCA1和CA1基因跨内含子DNA序列。     

靶向沉默PPP1R16A基因可抑制肝癌细胞的增殖

目的 观察和比较在人肝癌与癌旁组织中蛋白磷酸酶1调节亚基16A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 16A,PPP1R16A)基因在基因组和转录水平的差异,探讨靶向沉默PPP1R16A基因对肝癌细胞HCC LM3增殖能力的影响.方法 收集106例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR技术检测PPP1R16A基因的基因组和转录水平.体外合成PPP1R16A序列特异性小干扰RNA(siRNA),使用脂质体法转染肝癌细胞株HCC LM3.实验分si-16A组(针对PPP1R16A的特异性siRNA转染的HCC LM3细胞)、NC组(非特异性siRNA转染的HCC LM3细胞)、空白组(未转染siRNA的HCC LM3细胞),用实时荧光定量PCR检测PPP1R16A基因拷贝数和转录水平,用蛋白质印迹法检测PPP1R16A蛋白表达,用CCK-8实验、克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力,用流式细胞术检测细胞周期.结果 人肝癌组织中PPP1R16A基因的拷贝数和转录表达水平均高于癌旁组织(P＜0.01),且两者具有相关性(P=0.015).CCK-8实验和克隆形成实验显示,转染siRNA后,si-16A组细胞增殖低于NC组和空白组(P＜0.001).流式细胞术结果显示,si-16A组较NC组和空白组细胞周期被抑制.结论 肝癌组织中PPP1R16A的拷贝数发生扩增,基因转录上调.靶向沉默PPP1R16A能抑制肝癌细胞HCC LM3的增殖能力.提示PPP1R16A基因在肝癌中发挥癌基因的作用.     

Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鉴定及繁育方法

目的 探讨小凹蛋白-1(caveolin-1)基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式,为深入研究caveolin-1在脑缺血损伤修复中的作用提供理想的动物模型。方法 将引进的caveolin-1基因敲除小鼠饲养于SPF级实验室,煮沸裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,根据美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)提供的引物序列进行PCR反应检测其基因型,采用caveolin-1^+/-杂合子互交、杂合子与caveolin-1^-/-纯合子杂交(正交及反交)、纯合子互交4种不同的交配方式,观察亲代小鼠的受孕率、子代小鼠的外形特征及纯合率。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量大小约200 bp和661 bp,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了caveolin-1基因敲除小鼠的不同基因型;不同交配方式的繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌性、雄性caveolin-1^-/-纯合鼠具有一定的繁殖能力,三种不同基因型小鼠的外形特征无明显差异。结论 煮沸裂解法提取基因组DNA、PCR法能够快速可靠鉴定caveolin-1基因敲除小鼠的基因型;caveolin-1杂合子小鼠互交与纯合子互交相结合的繁育方法可能是短期内获得足量纯合子子鼠与同源野生子鼠的较好方式。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆

目的：构建弓形棒状体蛋白2（ROP2)基因重组质粒。方法：根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经酶切及PCR鉴定，而后进行测序。结果：ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因，为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础。